指狀青霉(Penicillium digitatum)新的甾醇調(diào)控蛋白(SreA)的功能研究及轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、柑橘綠霉菌又名指狀青霉(Penicillium digitatum)是柑橘類水果采摘后儲藏期間感染最為嚴重的病原菌，能引起果實腐爛，造成重大的經(jīng)濟損失。使用三唑類抗真菌藥物能有效地抑制綠霉菌的生長，緩解病害。然而藥物的長期使用造成了抗藥性菌株的出現(xiàn)，使綠霉病的防治變得更加困難。本論文旨在探究指狀青霉對農(nóng)藥咪酰胺的抗藥性及其對柑橘類水果侵染的分子機制，為新型抗真菌劑的設計及綠霉病的防治提供理論基礎。結(jié)合分子生物學與生物信息學方法，研究了指

2、狀青霉中一個新的甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白SreA的功能，揭示了它與指狀青霉抗藥性之間的關(guān)系;同時運用RNA-seq技術(shù)對指狀青霉經(jīng)咪酰胺誘導前后的轉(zhuǎn)錄組進行了測定和分析，首次在轉(zhuǎn)錄水平上探究指狀青霉的抗藥性機制。本研究主要實驗結(jié)果如下:
　　1、在指狀青霉的基因組中發(fā)現(xiàn)了一個與抗藥性相關(guān)的甾醇調(diào)控原件結(jié)合蛋白(SREBP)編碼基因。運用PCR技術(shù)、染色體步移技術(shù)、cDNA末端快速擴增技術(shù)克隆得到了該基因的全序列，命名為sreA。蛋白序

3、列分析顯示SreA蛋白的羧基端含有一個保守的DUF2014結(jié)構(gòu)域，氨基端含有螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域與甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白（SREBP）家族轉(zhuǎn)錄因子的功能相關(guān)。
　　2、通過根瘤農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成功構(gòu)建了柑橘綠霉菌咪酰胺抗性菌株P(guān)dHS-F6 sreA基因缺失突變株（ΔsreA）及回補突變株（COsreA），對突變體的特性進行了研究。結(jié)果表明ΔsreA突變菌株對咪酰胺的敏感性降低，與HS-F6野生型菌株及回補

4、菌株相比咪酰胺EC50值明顯下降。毒性測試實驗顯示ΔsreA菌株對柑橘類水果的毒性降低，而sreA基因的回補可以很大程度上恢復菌株的毒性。
　　3、熒光定量PCR結(jié)果表明在ΔsreA cyp51基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯下降。ΔsreA突變菌株相對于HS-F6野生型菌株三種cyp51基因cyp51A/B/C基因的相對表達量分別為0.02、0.29、0.47。證明sreA基因的缺失使指狀青霉cyp51基因的轉(zhuǎn)錄受到了抑制，其編碼蛋白參與

5、指狀青霉cyp51基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。同時探究了sreA基因在指狀青霉cyp51基因?qū)漉０忿D(zhuǎn)錄應答方面發(fā)揮的作用。HS-F6野生型菌株經(jīng)咪酰胺藥物誘導后藥物靶標酶cyp51A及cyp51B的表達發(fā)生上調(diào)，而在ΔsreA突變菌株中咪酰胺沒有誘導cyp51A及cyp51B基因的上調(diào)。這說明SreA蛋白是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與cyp51基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。綜上所述，sreA基因與指狀青霉對農(nóng)藥咪酰胺的抗性、對柑橘類水果的侵染毒力以及cyp51

6、基因的調(diào)控有關(guān)。此蛋白可作為新型殺菌劑的靶標，對真菌抗藥性機制的研究及新藥的設計具有重要的意義。
　　4、在轉(zhuǎn)錄組水平上進一步探究了柑橘綠霉菌咪酰胺高抗菌株HS-F6的抗藥性機制。提取指狀青霉抗性菌株(HS-F6)及敏感菌株(HS-E3)咪酰胺處理前后的總RNA，將樣品送至公司（北京諾禾致源生物信息有限公司）進行轉(zhuǎn)錄組測序。對測序的數(shù)據(jù)進行分析找出兩種菌株在基因表達上的差異。篩選出了可能與HS-F6抗性及咪酰胺藥物應答相關(guān)的基因。

7、結(jié)果顯示，咪酰胺脅迫處理前，菌株HS-F6與HS-E3在基因轉(zhuǎn)錄水平上有顯著的差異，共有1520個差異基因。將咪酰胺處理前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行對比，結(jié)果顯示敏感菌株HS-E3中存在224個與咪酰胺應答相關(guān)的基因，其中有154個基因表達下調(diào)，70個基因表達上調(diào);而在抗性菌株HS-F6中有1100個應答基因，其中有698個基因表達下調(diào)，402個基因表達上調(diào)。兩種菌株咪酰胺脅迫處理后共有的差異表達基因有82個，HS-E3特有的差異表達基因有14

8、1個，HS-F6特有的差異表達基因有1018個。
　　5、通過GO及KEGG聚類分析對差異基因進行篩選，找出了多個與抗藥性相關(guān)的藥物轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因。包括14個MFS(Major Facilitator Superfamily)家族的轉(zhuǎn)運蛋白;8個ABC家族的轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter)及3個MATE（multidrug and toxic compound extrusion fa