谷子抗拿捕凈基因的克隆和轉基因玉米的研究以及玉米抗拿捕凈體細胞無性系突變體的篩選.pdf

1、拿捕凈(Sethoxydim)是80年代初篩選出的一種高活性的除草劑,它屬于環(huán)己烯酮類,這類除草劑作用的靶蛋白是乙酰輔酶A羧化酶(ACCase).環(huán)己烯酮類除草劑被專門用來防治禾本科雜草,對雙子葉作物高度安全,但不能用于禾本科作物.由于這些除草劑具有用量少、活性高、在土壤中易分解等優(yōu)點,近年來在生產中得到了廣泛應用.該研究從高抗拿捕凈的谷子品系和普通谷子中克隆出了ACCase基因,并對它們的序列進行了比較,找出了拿捕凈作用的靶位點序列.

2、在此基礎上,將抗性谷子中克隆的ACCase基因轉入玉米自交系中,獲得抗拿捕凈的轉基因植株.同時采用組織培養(yǎng)的方法篩選玉米抗性突變體,獲得了有價值的抗性材料,并對其抗性機制進行了探討.在體細胞無性系突變體的篩選方面,我們直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度梯度的拿捕凈,通過多輪篩選,最后存活的愈傷組織被認為是抗性愈傷組織.對抗性愈傷組織進行誘導,最終分化成苗.該實驗共采用了兩個處理:處理一(采用0.5、1、2、5、10 μ M的拿捕凈濃度梯度)最終

3、獲得了31棵再生植株;處理二(采用5、10、20、50μ M的濃度梯度篩選)僅有綜31獲得了一個抗性愈傷組織,但無法分化成苗,該愈傷組織在200 μ M的拿捕凈濃度下依然能維持旺盛生長.克隆了這個抗性愈傷組織的質體ACCase基因,序列比對發(fā)現(xiàn),它編碼的氨基酸并沒有發(fā)生改變.Southern blotting結果表明,它與對照的雜交信號并沒有明顯的變化,但雜交條帶的大小發(fā)生了變化.Northern blotting結果表明,雜交信號比對

4、照增加了2.5倍.根據(jù)禾本科作物質體ACCase cDNA序列的保守性,直接采用RACE技術從高抗拿捕凈的谷子品系和野生型谷子中克隆出ACCase基因,采用生物信息學的方法證明所克隆的基因編碼質體ACCase而非胞質溶膠ACCase.將它們的氨基酸序列與其它物種的真核型ACCase相比較,發(fā)現(xiàn)抗拿捕凈谷子質體ACCase氨基酸序列的1780處為異亮氨酸,而野生型谷子的為亮氨酸,從而驗證了質體ACCase CT功能域的這個單一的氨基酸殘基

5、是拿捕凈作用的靶位點,它的突變造成了谷子對拿捕凈抗性的改變.Southern blotting結果表明,質體ACCase基因在谷子中只有一個拷貝.將克隆的谷子抗拿捕凈質體ACCase全長cDNA構建到植物表達載體中.首先對植物表達載體pCAMBIA3301進行了改造,去除了篩選標記基因,將35S啟動子換上了在禾本科植物細胞中高效表達的啟動子UBI,去除了GUS基因,最后將抗拿捕凈谷子質體ACCase全長cDNA構建到其上.采用根癌農桿菌