禽白血病p27基因的原核表達(dá)和兔抗p27抗體的制備.pdf

1、該研究根據(jù)已發(fā)表的AMV BAI-A株的基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,以重組質(zhì)粒pGEM-gag為模板,采用PCR法對(duì)p27基因進(jìn)行亞克隆,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-p27.對(duì)重組質(zhì)粒PGEM-p27和表達(dá)載體pET-28α進(jìn)行雙酶切,回收酶切產(chǎn)物,連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒.將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,篩選含重組質(zhì)粒的基因工程菌.重組工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到高效表達(dá),其細(xì)胞裂解物用SDS—PAGE及Western

2、 blotting進(jìn)行檢測(cè).用Ni-NTA親和層析法純化表達(dá)蛋白,經(jīng)SDS—PAGE方法及Western blotting檢測(cè),分析純化的蛋白.用p27蛋白按照常規(guī)的方法免疫健康家兔,5周后收集兔血清,用瓊脂擴(kuò)散法和ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià),用Western blotting檢測(cè)其特異性.結(jié)果表明,該研究成功地亞克隆了禽白血病p27基因.所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET28α-p27在BL21(DE3)中成功表達(dá)了分子量約為30KDa的融合蛋

3、白,與預(yù)測(cè)的大小一致.薄層掃描的結(jié)果顯示p27蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白的25.3％.Western blotting檢測(cè)顯示表達(dá)的重組蛋白是特異性的.經(jīng)Ni-NTA樹(shù)脂純化得到的產(chǎn)物純度達(dá)97％.用瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)抗血清的效價(jià)能達(dá)到1:32.用抗血清作為一抗進(jìn)行Western blotting檢測(cè),結(jié)果表明此抗血清是針對(duì)p27的多抗.用抗血清作為包被抗體,用AMV血毒作為檢測(cè)抗原,進(jìn)行ELISA試驗(yàn),結(jié)果表明當(dāng)抗血清稀釋到4000倍時(shí),其