四種結(jié)核潛伏感染蛋白制備及免疫學特性研究.pdf

1、目的:獲得結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)重組蛋白Rv2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c,并評價其免疫學特性及其應用價值。
　　方法:應用基因工程技術(shù)克隆、表達并純化結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白Rv2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c,并對蛋白表達條件進行優(yōu)化。進一步用純化的重組蛋白Rv2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c刺激376例中國人PBMC,其中包括未感染結(jié)核健康對照組

2、103例、結(jié)核潛伏感染組51例、活動性結(jié)核病組116例、BCG接種組49例(Rv1813c無此組)、非結(jié)核呼吸疾病組57例,用ELISPOT技術(shù)檢測分泌IFN-γ的效應T細胞斑點數(shù)(SFC),比較其在不同人群中的差異,評價它們在抗結(jié)核潛伏感染細胞免疫應答中的作用;用 ELISA方法檢測未感染結(jié)核的健康對照組72例、結(jié)核潛伏感染組36例及活動性結(jié)核病組62例共計170例人血清中4種蛋白特異性抗體IgG的水平,并比較組間差異,評價4種潛伏感

3、染相關(guān)蛋白在抗結(jié)核體液免疫方面的作用;以潛伏感染組效應T細胞SFC為陽性組,以活動性結(jié)核病組SFC為陰性組,繪制各個潛伏抗原鑒別結(jié)核活動性感染與潛伏感染的ROC曲線,在特異度80％及90%兩個點取SFC的cut-off值,以此評價并且比較潛伏感染蛋白對結(jié)核活動性感染與潛伏感染的鑒別診斷效能。
　　結(jié)果:1、本研究制備并獲得純度較高的重組蛋白Rv2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c,其純度均達到95%以上。2、重

4、組蛋白Rv2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c刺激中國潛伏感染人群后分泌IFN-γ的效應T細胞數(shù)顯著高于活動性結(jié)核病組(p<0.05),也顯著高于未感染正常對照組(p<0.05);Rv2029c、Rv2659c、Rv1813c在非結(jié)核呼吸疾病組顯著低于結(jié)核潛伏感染組(p<0.05),Rv2628在非結(jié)核呼吸疾病組低于潛伏感染組,但差異不明顯(p>0.05),與未感染健康對照組無顯著差別(p>0.05);BCG接種3個

5、月后PPD陽轉(zhuǎn)者與健康對照組潛伏蛋白特異的SFC值進行比較,兩者之間差異不明顯(p>0.05),BCG接種前后潛伏感染蛋白刺激的SFC值無顯著差異(p>0.05)。3、Rv1813c蛋白特異的IgG值在活動性結(jié)核病組顯著高于未感染的健康對照組和潛伏感染組(p<0.05),而其余3個蛋白特異的IgG水平在這三組間差異不顯著(p>0.05)。4、ROC曲線分析結(jié)果:Rv2029c蛋白的曲線下面積最高達到89.1%,高于Rv2659c(69.

6、9%)、Rv2628(68.8%)及Rv1813c(39%)。Rv2029c、Rv2659c及Rv2628蛋白誘導潛伏感染組產(chǎn)生細胞免疫應答的陽性率最高。進一步評價各潛伏蛋白對鑒別結(jié)核活動感染與潛伏感染效能,Rv2029c靈敏度最高,在潛伏感染人群中的陽性率達到80%以上,但在未感染結(jié)核的健康組和活動性結(jié)核病組的假陽性率較高;Rv2659c雖然靈敏度不及Rv2029c,但其在未感染結(jié)核的健康組和活動性結(jié)核病組的假陽性率低;Rv2628的

7、靈敏度與 Rv2659c相當,但其假陽性率高于Rv2659c,低于Rv2029c。
　　結(jié)論:1、本研究成功地構(gòu)建了四種結(jié)核潛伏感染相關(guān)蛋白Rv2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c高表達的基因工程菌株,獲得的重組蛋白純度高。2、Rv2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c可被結(jié)核潛伏感染人群識別,誘導其效應T細胞產(chǎn)生的免疫應答強于活動性結(jié)核病患者。3、重組Rv2659c蛋白通過ELISPOT技術(shù)