幾種鱗翅目昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)從預(yù)蛹期甜菜夜蛾、粘蟲(chóng)、玉米螟、二化螟四種昆蟲(chóng)體內(nèi)各分離克隆了一條幾丁質(zhì)酶基因序列，序列長(zhǎng)度分別為2838、2810、3343、2237個(gè)堿基，分別包括一個(gè)1674、1677、1662和1659個(gè)堿基的的開(kāi)放讀碼框，編碼557、558、553、552個(gè)氨基酸，分子量分別為62.6、62.8、61.8和61.4kDa，等電點(diǎn)分別為5.2，5.05，5.28和5.17。 　　由四種害蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列為多結(jié)構(gòu)域序列

2、，包括N-端的活性催化區(qū)(Catalyticdomain)，C-端富含半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)(Chitin-bindingdomain2)。序列比對(duì)表明，在催化區(qū)中含有兩個(gè)高度保守的區(qū)域，一個(gè)是KFMVAVGGWAEGS，另一個(gè)是YDFDGLDLDWEYP，而第二個(gè)高度保守區(qū)是酶的催化活性中心區(qū)。在催化區(qū)和幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)中間有一個(gè)被稱為L(zhǎng)inker的富含脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和谷氨酸的區(qū)域(PESTrichdomain)。除了幾丁質(zhì)酶催化

3、區(qū)、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和Linker區(qū)外，在克隆的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶N-端成熟蛋白的前端還都含有一個(gè)疏水性、大約在20個(gè)氨基酸左右的信號(hào)肽。 　　昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶是一種糖蛋白，糖基化對(duì)酶的活化是至關(guān)重要的。Linker區(qū)一般要經(jīng)過(guò)O-位的高度糖基化修飾，而在催化區(qū)也會(huì)有部分N-位糖基化修飾。利用NetOGlyc2.0軟件發(fā)現(xiàn)在甜菜夜蛾幾丁質(zhì)酶氨基酸序列中有23個(gè)O-位糖基化位點(diǎn)，粘蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列中有21個(gè)O-位糖基化位點(diǎn)，而玉米螟和二化螟幾丁質(zhì)

4、酶氨基酸序列中均具有29個(gè)O-位糖基化位點(diǎn)。N-位糖基化修飾的位點(diǎn)數(shù)目也是不一樣的，甜菜夜蛾、粘蟲(chóng)和玉米螟3種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列中存在2個(gè)N-位糖基化位點(diǎn)，二化螟幾丁質(zhì)酶氨基酸序列中存在3個(gè)N-位糖基化位點(diǎn)。除O-位和N-位糖基化位點(diǎn)以外，昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列中還存在多個(gè)硫酸化和磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可以通過(guò)Expasy分子生物學(xué)服務(wù)器上的Prosite軟件找到，它們的存在對(duì)于蛋白功能的發(fā)揮均起到一定的作用。 　　通過(guò)NCBI上的

5、Blast軟件比較分析，甜菜夜蛾幾丁質(zhì)酶氨基酸序列與煙草天蛾幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性達(dá)到81％，與棉鈴蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性達(dá)到87％，與斜紋夜蛾幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性達(dá)到96％，與美國(guó)白蛾幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性達(dá)到83％，與其他鱗翅目昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性達(dá)到也達(dá)到75％以上。其他3種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列與已經(jīng)發(fā)表的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列進(jìn)行比較也得到了類似結(jié)果，說(shuō)明我們克隆得到的序列是編碼昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶的cDNA的序列

6、，是四種新的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因，其中玉米螟和二化螟幾丁質(zhì)酶基因是首次克隆的鱗翅目螟蛾科昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因。 　　四種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因cDNA序列已經(jīng)分別命名為Sechi，Mechi，Ofchi，Cschi，在GenBank上的登錄號(hào)分別為AY658731，AY508698，AY726548，AY705930。 　　利用大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)甜菜夜蛾和粘蟲(chóng)的幾丁質(zhì)酶基因分別進(jìn)行了表達(dá)。用Novagen公司的大腸桿菌pET表達(dá)系統(tǒng)和Bio

7、lab公司的Impact表達(dá)系統(tǒng)對(duì)甜菜夜蛾和粘蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果pET系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白分子量為80kDa，是以沒(méi)有活性的包涵體的形式存在，而Impact系統(tǒng)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)蛋白分子量為116kDa(包括55kDaInteintag)，可以通過(guò)超聲波裂解進(jìn)入到上清中，形成可溶性蛋白。同時(shí)利用畢赤酵母表達(dá)了甜菜夜蛾幾丁質(zhì)酶基因，表達(dá)的產(chǎn)物約為75kDa，可以直接進(jìn)入培養(yǎng)基上清液中，形成分泌型表達(dá)。 　　對(duì)大腸桿菌pET系統(tǒng)表達(dá)的

8、昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶包涵體蛋白進(jìn)行了變性和復(fù)性研究，得到了可溶性的幾丁質(zhì)酶蛋白。 　　以LOEWE公司的carboxymethylRemazolBrilliantvioletchitin(CM-Chitin-RBV)為底物檢測(cè)到三個(gè)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶融合蛋白均具有明顯的幾丁質(zhì)酶活性；同時(shí)表達(dá)的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶對(duì)以甜菜夜蛾、粘蟲(chóng)、玉米螟和二化螟的中腸圍食膜制備成的膠體幾丁質(zhì)具有分解功能。 　　利用大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶對(duì)粘蟲(chóng)

9、、小菜蛾和甜菜夜蛾進(jìn)行了殺蟲(chóng)活性測(cè)定，單獨(dú)使用幾丁質(zhì)酶對(duì)幾種昆蟲(chóng)殺蟲(chóng)效果不理想，而與Bt混用殺蟲(chóng)和Bt單獨(dú)使用殺蟲(chóng)效果差異不顯著。同時(shí)對(duì)幾丁質(zhì)酶在中腸消化液中的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明在2個(gè)小時(shí)內(nèi)中腸中的蛋白水解酶可以較完全地消化幾丁質(zhì)酶。 　　以上結(jié)果證明表達(dá)的昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶可以降解昆蟲(chóng)腸道圍食膜內(nèi)的幾丁質(zhì)成分，但由于酶本身沒(méi)有經(jīng)過(guò)糖基化等翻譯后的加工過(guò)程使酶活性相對(duì)較低且不穩(wěn)定，在昆蟲(chóng)取食后沒(méi)有較好發(fā)揮酶功能之前被蛋白水解酶所水解

10、，進(jìn)一步的工作可以通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞系表達(dá)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶，提高其活性和抗蛋白酶能力以最終提高其殺蟲(chóng)效果。 　　利用酶活性測(cè)定和半定量RT-PCR對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)到蛹期的發(fā)育過(guò)程中均有轉(zhuǎn)錄和翻譯階段幾丁質(zhì)酶的表達(dá)，但各個(gè)時(shí)期表達(dá)量是不一樣的，幼蟲(chóng)蛻皮之前mRNA的表達(dá)量高于蛻皮之后，預(yù)蛹期mRNA的表達(dá)量最高，幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定結(jié)果也表明，預(yù)蛹期幾丁質(zhì)酶活性最強(qiáng)；6齡幼蟲(chóng)昆蟲(chóng)不同組織幾丁質(zhì)酶表