土壤中TMV LAMP檢測技術(shù)的建立及土壤傳播TMV的效率研究.pdf

1、煙草花葉病毒?。═obacco mosaic virus，TMV）在煙草、番茄等作物上是很重要的病害，世界各地發(fā)生普遍，中國各大煙區(qū)，均有發(fā)生，煙田發(fā)病率在5％-20%，損失嚴(yán)重。前人研究明確指出，植煙土壤可傳播TMV。但關(guān)于煙田土壤TMV的傳播效率問題，至今還未有人進(jìn)行詳細(xì)的研究，只是從理論上認(rèn)為有傳毒功能，并無詳細(xì)的數(shù)據(jù)分析為支撐。
　　本研究在建立并優(yōu)化的檢測TMV的LAMP快速檢測方法的基礎(chǔ)上，分別對湖南省桂陽縣實(shí)驗(yàn)煙田煙

2、葉和煙草根際土壤樣品進(jìn)行檢測，并對葉片和土壤中的TMV CP核苷酸序列進(jìn)行了同源性分析，明確植株中TMV的來源，根據(jù)所得數(shù)據(jù)分析土壤中TMV傳播效率。為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采集田間的攜帶TMV的土壤，在實(shí)驗(yàn)室溫室內(nèi)，盆栽無毒煙苗，并用優(yōu)化好的LAMP方法檢測葉片TMV發(fā)病情況。獲得研究結(jié)果如下：
　　1、利用E.Z.N.A. TM Soil RNA Kit提取土壤RNA，后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，引用已報(bào)道的LAMP TMV特異性引

3、物，優(yōu)化了LAMP反應(yīng)體系與條件，最終確定反應(yīng)體系為：1.6μM FIP\BIP，0.2μM F3\B3，4.0mM Mg2+，0.25mM dNTPs，Bst DNApol（8U）1.0μL，cDNA5.0μL。反應(yīng)條件：62℃恒溫水浴鍋反應(yīng)1h，80℃，終止反應(yīng)10min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，成像儀中獲得明亮、離散型、梯度條帶；檢測靈敏度為RT-PCR的10-100倍。
　　2、在上一年TMV發(fā)病嚴(yán)重的煙田中移栽無

4、毒煙苗后，用10個(gè)防蟲網(wǎng)罩，遮蓋35株煙苗，每15天采集一次葉片及相應(yīng)植株根基土壤，采集3次，每次開網(wǎng)采集后葉片均勻噴施殺蟲劑。利用E.Z.N.A. TM Soil RNA Kit提取土壤樣品RNA，用EASY spin植物RNA快速提取試劑盒提取葉片樣品RNA，后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板，用建立并優(yōu)化好的LAMP方法檢測田間采集的樣品，得到煙草與根基土壤均帶毒的植株占根基帶毒總數(shù)的百分率由最初的12%，增加到96%，總煙草帶毒

5、率由最初的
　　8.57%，增長到94.28%，增幅較大；實(shí)驗(yàn)室溫室內(nèi)，將大田采集的帶有TMV的土壤，一部分直接盆栽無毒煙苗，作為實(shí)驗(yàn)組；另一部分高壓蒸汽滅菌，盆栽無毒煙苗作為對照組1；另用實(shí)驗(yàn)室無菌土盆栽煙苗，作為對照組2；同樣采用LAMP方法檢測，結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組6株，有5株檢測出TMV，發(fā)病率83.33%；對照組1，有2株檢測出TMV，檢出率為33.33%，對照組2有1株檢測出TMV，檢出率為16.67%，TMV檢出率較小；綜合

6、田間和溫室實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，證明土壤有較高傳播TMV效率；
　　3、對桂陽土壤樣品GYS1、GYS3、GYS6，煙葉樣品GYL1、GYL2、GYL3、GYL5、GYL6、GYL7，TMV分離物的CP測序分析，結(jié)果顯示，土壤樣品與煙葉樣品的核苷酸序列同源性在96.3%-99.4%，同源性較高；在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，均在同一分支Ⅰ上，且與來自俄羅斯的KJ406323.1株系，越南的LN651235.1、AM412008.1，中國河南的HQ89602

7、5.2在同一分支中，有較高相似性，其中與HQ896025.2株系核苷酸序列同源性在97.1%-98.1%；進(jìn)一步驗(yàn)證葉片組織中的TMV來自土壤；
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所建立的快速檢測TMV的LAMP方法，不需要昂貴PCR設(shè)備，具有很強(qiáng)的特異性，很高靈敏度，為田間快速準(zhǔn)確的檢測土壤中的TMV，進(jìn)而做好防治提供了一條便捷途徑。利用該方法檢測田間煙草根圍土樣及對應(yīng)煙株中的TMV，結(jié)果顯示土壤中的TMV確有較高的傳播效率，經(jīng)TMV CP序