靶向豬CLTC基因的miRNA對乙腦病毒侵入PK15細胞作用的研究.pdf

1、乙型腦膜炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）為蟲媒病毒，屬于黃病毒科。能夠在世界范圍內(nèi)引起嚴重的急性腦膜炎疾病。豬是乙型腦膜炎病毒的貯存宿主，豬-蚊-豬，豬-蚊-人的循環(huán)傳播嚴重威脅著人類的健康，同時乙型腦炎病毒還可以造成母豬的流產(chǎn)或者死胎以及公豬的睪丸炎疾病，對畜牧業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。microRNA是一類內(nèi)源性的長度約20-23nt的一類非編碼RNA，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，越來越

2、多的研究表明，宿主miRNA具有抗病毒感染的作用。不同的病毒侵入不同的細胞需要不同的入胞途徑，其中，網(wǎng)格蛋白介導的包吞途徑研究的較為清楚，網(wǎng)格蛋白最基本的亞單位是由三個重鏈和三個輕鏈組成，相關(guān)研究報道，乙型腦炎病毒通過網(wǎng)格蛋白介導的胞吞途徑侵入豬腎上皮細胞系PK15，所以本項目擬以豬CLTC基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控為切入點，鑒定靶向豬CLTC基因的miRNA，并探究miRNA-clathrin包被小窩通路在乙型腦膜炎病毒侵入PK15細胞中的作用

3、機制。
　　本研究通過生物信息學的方法初步篩選出靶向豬CLTC基因的6條ssc-miRNA mimics，并進一步使用雙熒光素酶檢測試劑盒，Western Blot技術(shù)以及實時熒光定量PCR的方法驗證出靶向豬CLTC基因的ssc-miRNA mimics，試驗將miRNA與豬CLTC基因的配對堿基突變作為陰性對照，明確證實了靶向豬CLTC基因的ssc-miRNA mimics，并進一步驗證了miRNA與豬CLTC基因的靶向機理。采

4、用實時熒光定量PCR的方法檢測靶向豬CLTC基因的miRNA對乙型腦膜炎病毒侵入豬PK15細胞的影響。同時，利用實時熒光定量PCR的方法檢測敲低CLTC基因表達后對乙型腦膜炎病毒侵入豬PK15細胞的影響。最后，乙型腦膜炎病毒感染豬PK15細胞以后利用實時熒光定量PCR的方法探索不同時間點miRNA和其靶基因CLTC的表達變化規(guī)律。
　　試驗結(jié)果表明：實時熒光定量PCR，Western Blot技術(shù)以及雙熒光素酶檢測試驗相結(jié)合，驗證

5、了靶向豬CLTC基因的2條miRNA mimics，分別是：ssc-miR-1和ssc-miR-129-5p；利用點突變試驗證實ssc-miR-1和ssc-miR-129-5p能夠靶向豬CLTC基因，且ssc-miR-1通過堿基配對與豬CLTC基因互補結(jié)合，完全遵循“種子規(guī)則”。而ssc-miR-129-5p抑制豬CLTC基因的表達沒有遵循“種子規(guī)則”，不具有物種保守性；定量檢測結(jié)果表明，靶向豬CLTC基因的miR-1和miR-129-