靶向基因shRNA干擾家蠶及豬若干病毒的復(fù)制和增殖研究.pdf

1、RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病的基因治療領(lǐng)域。
　　 1豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus2，PVC2）病毒是我國(guó)豬場(chǎng)疫病復(fù)雜的重要原因，可以說(shuō)它對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)

2、業(yè)正常維持帶來(lái)了極大的困難，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的影響目前受到了僅次于高致病性藍(lán)耳病的空前關(guān)注，且目前尚無(wú)有效疫苗與治療方法。本文根據(jù)PVC2型病毒-Rep、Cap和ORF3/ORF4基因的結(jié)構(gòu)序列和shRNA序列設(shè)計(jì)原則，進(jìn)行地毯式搜索并設(shè)計(jì)合成了139對(duì)針對(duì)PVC2型病毒-Rep蛋白基因、134對(duì)針對(duì)PVC2型病毒-Cap蛋白基因、18對(duì)針對(duì)PVC2型病毒-ORF3/ORF4基因的shRNA序列，共計(jì)291對(duì)PVC2型病毒靶向shRNA。

3、將設(shè)計(jì)合成的291對(duì)shRNAs連接到線性化的RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen載體上，構(gòu)建成RNA干擾載體。分別在轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下導(dǎo)入無(wú)PCV2污染的豬腎PK15細(xì)胞，24小時(shí)后進(jìn)行熒光觀察，確定轉(zhuǎn)染效率。并在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞接種PCV2病毒，接毒72小時(shí)后收集細(xì)胞，通過(guò)Real-Time PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中病毒的相對(duì)表達(dá)量，從而分析所設(shè)計(jì)的shRNA對(duì)PCV2病毒的抑制作用。結(jié)果表明，針對(duì)Rep基因序

4、列設(shè)計(jì)的139對(duì)shRNAs中，pSIREN-REP-C，pSIREN-REP-4, pSIREN-REP-23', pSIREN-REP-30', pSIREN-REP-33',pSIREN-REP-67'，pSIREN-REP-75'，pSIREN-REP-80'共8個(gè)序列表現(xiàn)出對(duì)PVC2病毒復(fù)制與增殖的抑制作用;針對(duì)Cap基因序列所設(shè)計(jì)的134對(duì)shRNAs中，pSIREN-Cap-3，pSIREN-Cap-5，pSIREN-Ca

5、p-C11'，pSIREN-Cap-14，pSIREN-Cap-80共5個(gè)序列表現(xiàn)出對(duì)PVC2病毒復(fù)制增殖的抑制作用，而針對(duì)ORF3和ORF4所設(shè)計(jì)的18對(duì)shRNAs并沒(méi)有表現(xiàn)出較顯著的對(duì)PVC2病毒復(fù)制增殖的抑制作用。綜上所述，以上對(duì)PCV2具有顯著抗病毒能力的shRNA靶向基因序列可作為轉(zhuǎn)基因的候選shRNA序列。
　　 2豬繁殖與呼吸綜合癥（Porcine Reproductive and Respiratory Syn

6、drome，PRRS）俗稱(chēng)豬藍(lán)耳病，是一種新的豬傳染病，能夠引起母豬的生殖障礙及仔豬的呼吸道癥狀，在世界各地危害很大。豬生殖和呼吸系統(tǒng)綜合癥病毒（PRRSV）由ORF5、ORF6分別編碼的GP5、M蛋白是PRRSV病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它們?cè)诓《镜闹虏⌒?、病毒?fù)制、病毒裝配、病毒變異和保護(hù)性反應(yīng)等方面具有重要意義。本文根據(jù)豬藍(lán)耳病病毒PRRSV-ORF5及PRRSV-ORF6的基因結(jié)構(gòu)序列和shRNA序列設(shè)計(jì)原則，分別設(shè)計(jì)和合成了5對(duì)針對(duì)

7、PRRSV-ORF5，5對(duì)針對(duì)PRRSV-ORF6編碼蛋白基因序列的靶向shRNA。將設(shè)計(jì)合成的shRNA連接到線性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體上，構(gòu)建成RNA干擾載體。將上述質(zhì)粒DNA，分別在轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下導(dǎo)入Marc-145細(xì)胞，24小時(shí)后進(jìn)行熒光觀察，確定轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種PRRSV病毒，72小時(shí)后收集細(xì)胞，通過(guò)Real-Time PCR方法檢測(cè)病毒感染后的相對(duì)表達(dá)量，分析所設(shè)

8、計(jì)的shRNA對(duì)PRRSV病毒的抑制作用。結(jié)果表明，分別針對(duì)ORF5和ORF6設(shè)計(jì)的共10對(duì)shRNAs均表現(xiàn)出抑制PRRSV病毒增殖復(fù)制的作用，但不同shRNA的抑制效果存在差異(0.71％-67.52％)。其中以O(shè)RF6-6e的病毒相對(duì)表達(dá)量最低，細(xì)胞內(nèi)病毒表達(dá)量?jī)H為0.71％，即抗病毒能力最強(qiáng)，因此該序列可作為轉(zhuǎn)基因的候選shRNA序列。
　　 采用piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建轉(zhuǎn)座載體，為了便于篩選，以RNAi-Readyp

9、SIREN-RetroQ-ZsGreen載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ZsGFP基因，連接到PXL-BACⅡ上形成重組載體PXL-BACⅡ-ZsGFP;再以pSilencer4.1-CMVneo載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Neomycinr基因，與PXL-BACⅡ-ZsGFP連接，形成重組載體PXL-BACⅡ-ZsGFP-Neo。為了后期能將這兩個(gè)篩選基因給剔除掉，又在ZsGFP基因和Neomycinr基因的兩端加入了 FRT位點(diǎn)，形

10、成最終的轉(zhuǎn)座載體PXL-BACⅡ-FRT-ZsGFP-Neo。最后將在上述活性篩選試驗(yàn)中挑選的具有最佳抗病毒能力的 shRNA(ORF6-6e)構(gòu)建到該轉(zhuǎn)座載體，命名為PXL-BACⅡ-FRT-ZsGFP-Neo-shRNA。該轉(zhuǎn)基因載體同時(shí)具有篩選基因和標(biāo)記基因，便于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的建立。該細(xì)胞株可穩(wěn)定傳代，以細(xì)胞基因組和RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，分別經(jīng)PCR和RT-PCR確認(rèn)，表明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因shRNA轉(zhuǎn)錄框、標(biāo)記基因

11、GFP和篩選基因Neo均可正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。該細(xì)胞株相對(duì)于正常Marc-145細(xì)胞具有較顯著的抗病毒能力，病毒相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.01％，表明病毒在該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)無(wú)法復(fù)制增殖。該研究為抗PRRSV病毒轉(zhuǎn)基因豬品種的培育與鑒定建立了方法，奠定了基礎(chǔ)。
　　 3家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）所引起的血液型膿病，是家蠶病毒病的主要類(lèi)型，是在我國(guó)乃至世界養(yǎng)蠶業(yè)危害較為嚴(yán)重的

12、一種病毒病。家蠶抗病能力除了作為宿主本身的家蠶抗性機(jī)理外，作為病原一方的復(fù)制增殖也同樣重要，正所謂“無(wú)菌不成病”。本文正是從BmNPV在家蠶體內(nèi)的復(fù)制繁殖的角度開(kāi)展研究。以BmNPV病毒的結(jié)構(gòu)序列和shRNA序列設(shè)計(jì)原則，分別針對(duì)病毒復(fù)制增殖所必需的極早期表達(dá)因子ie-1，晚期表達(dá)因子lef-1，lef-2和lef-3等靶基因設(shè)計(jì)合成32對(duì)shRNA，以BmN細(xì)胞基因組為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到BmU6啟動(dòng)子，構(gòu)建重組載體PXL-B

13、ACⅡ-GFP-BmU6-shRNA。將上述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞后接種BmNPV病毒，72小時(shí)后收集細(xì)胞，采用Real-Time PCR方法檢測(cè)病毒感染細(xì)胞后的相對(duì)表達(dá)量，以分析不同shRNA的抑制病毒復(fù)制與增殖活性。結(jié)果表明:shRNAs均表現(xiàn)出對(duì)BmNPV的抗病毒能力，但效果大有不同。其中，靶基因序列長(zhǎng)度為21bp的shRNA-ie1c表現(xiàn)出對(duì)BmNPV復(fù)制增殖具有極顯著的抑制作用，病毒相對(duì)表達(dá)量?jī)H為5.5％，其次為L(zhǎng)ef3

14、e-2。與此同時(shí)，本試驗(yàn)還設(shè)計(jì)并比較了不同靶序列長(zhǎng)度:19bp和21bp在抑制BmNPV病毒增殖復(fù)制時(shí)的作用和差別。結(jié)果表明，lef1b(85％)和lef1b-2(29％)，lef2d(91％)和lef2d-2(38％)的抗病毒能力效果差異顯著，靶序列長(zhǎng)度為21bp的病毒相對(duì)表達(dá)量較19bp病毒相對(duì)表達(dá)量分別減少56％和53％，說(shuō)明shRNA干擾靶序列長(zhǎng)度為21bp的RNA干擾病毒復(fù)制增殖效果優(yōu)于19bp。
　　 經(jīng)shRNA活

15、性篩選32對(duì)特異干擾靶向shRNA，分別針對(duì)極早期表達(dá)因子ie-1和晚期表達(dá)因子lef3的ie1c和lef3e-2表現(xiàn)出良好的抑制BmNPV的作用，因此將ie1c和lef3e-2作為轉(zhuǎn)基因的候選shRNA序列，構(gòu)建到含有篩選基因Neo的轉(zhuǎn)座重組載體上，并構(gòu)建單聯(lián)和雙聯(lián)重組轉(zhuǎn)座子載體，分別命名為PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA(ie1c)-Neo和PXL-BACⅡ-GFP-double(ie1c/lef3e2)-Neo。在細(xì)

16、胞水平進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，建立含抗BmNPV病毒shRNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，評(píng)價(jià)其抑制病毒增殖活性。結(jié)果表明單聯(lián)重組轉(zhuǎn)座載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相對(duì)于正常BmN細(xì)胞具有較顯著的抗病毒能力:病毒感染0-24h，對(duì)照組細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)的病毒相對(duì)表達(dá)量均較低，分別為7.15％和0.45％，盡管在病毒感染初期，病毒DNA剛開(kāi)始復(fù)制，仍可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞已初步表現(xiàn)出抗病毒增殖的能力;24-48h，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)病毒表達(dá)量呈指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)(56.23％)，增加了49

17、.08％，而轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組病毒相對(duì)表達(dá)量仍能維持較低水平(7.04％);48-96h，對(duì)照組細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組的病毒相對(duì)表達(dá)量處于穩(wěn)定期，對(duì)照組病毒表達(dá)量始終維持較高水平(56.23％-64.03％)，高于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組約47％-52％;病毒感染96h后，正常細(xì)胞組的病毒相對(duì)表達(dá)量又呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，約90％細(xì)胞的核內(nèi)充滿多角體，細(xì)胞死亡率上升，同時(shí)，隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組抑制病毒復(fù)制增殖效果略有下降，但轉(zhuǎn)基因細(xì)胞病毒相對(duì)表達(dá)量仍

18、低于對(duì)照組細(xì)胞約30％-50％。因此，在感染BmNPV后0-96h內(nèi)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表現(xiàn)出較好的抑制病毒增殖與復(fù)制的能力。
　　 雙聯(lián)重組轉(zhuǎn)座載體中含有上述活性檢測(cè)選出的兩條效果最好的shRNAs(ie1c/lef3e2)，其轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的病毒相對(duì)表達(dá)量為42.49％，雖然較正常BmN細(xì)胞內(nèi)病毒表達(dá)量低，但是其抗病毒效果顯著低于單聯(lián)轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(7.04％)的抗病毒能力。通過(guò)PCR、RT-PCR等方法確定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因均能正