2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景及目的:前期高通量測序結(jié)果顯示,miRNA156、miRNA1511、miRNA8155在甘草水煎劑miRNA中豐度較高。本研究通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞的增殖情況及免疫相關(guān)基因表達(dá)方面探究甘草的miRNA156、miRNA1511、miRNA8155對人免疫細(xì)胞的影響。通過表達(dá)譜測序發(fā)現(xiàn)差異基因并加以驗(yàn)證,從而為甘草藥效新機(jī)制的相關(guān)研究開拓新的思路。
  方法:
  1、根據(jù)高通量測序結(jié)果中的miRNA156、miRNA15

2、11、miRNA8155序列,設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄及檢測引物,通過RT-PCR確認(rèn)甘草組織miRNA中確實(shí)存在前期從其水煎劑中通過高通量測序技術(shù)鑒定出來的幾種microRNA分子:miRNA156、miRNA1511、miRNA8155。
  2、使用FAM標(biāo)記的小分子DNA來驗(yàn)證脂質(zhì)體Lip2000的轉(zhuǎn)染效率以建立可靠的轉(zhuǎn)染方法;設(shè)計(jì)合成miRNA156、miRNA1511和miRNA8155相對應(yīng)的mimic;將其分別通過Li

3、p2000轉(zhuǎn)染人的免疫細(xì)胞(PBMC、CIK、Jurkat細(xì)胞系),并以無關(guān)的miRNA NC mimic作為陰性對照組;使用顯微鏡觀察并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來比較各組間細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖情況;使用RT-PCR檢測各組細(xì)胞間部分免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。
  3、將各miRNA mimic轉(zhuǎn)染健康人PBMC細(xì)胞,培養(yǎng)24小時(shí)后,提取細(xì)胞的總RNA,進(jìn)行表達(dá)譜測序,分析各組細(xì)胞基因表達(dá)的差異,并通過GO及KEGG富集分析對差異基因進(jìn)行分類

4、和注釋。
  4、使用Real-time PCR及Western-blotting技術(shù)分別從基因水平和蛋白水平來驗(yàn)證表達(dá)譜測序結(jié)果的可靠性。
  結(jié)果:
  1、通過RT-PCR檢測目標(biāo)miRNA,發(fā)現(xiàn)甘草組織總RNA中確實(shí)能檢測到miRNA156、miRNA1511、miRNA8155,驗(yàn)證了前期高通量測序結(jié)果,為后續(xù)研究奠定了可靠基礎(chǔ)。
  2、通過用Lip2000轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的小分子DNA,倒置熒光顯微鏡

5、下觀察發(fā)現(xiàn)Lip2000有較高的轉(zhuǎn)染效率。制備合成了miRNA156、miRNA1511、miRNA8155相對應(yīng)的miRNA mimic,并成功通過Lip2000轉(zhuǎn)染進(jìn)人的免疫細(xì)胞(PBMC、CIK、JURKAT細(xì)胞);實(shí)驗(yàn)組與對照組間細(xì)胞形態(tài)有明顯差異;甘草的三個(gè)miRNA對PBMC細(xì)胞和CIK細(xì)胞生長有增殖作用,而對急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系JURKAT的生長存在明顯抑制作用。RT-PCR結(jié)果顯示,甘草miRNA使PBMC、CIK、J

6、URKAT細(xì)胞中部分免疫相關(guān)細(xì)胞因子、信號分子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平發(fā)生了顯著的變化。
  3、表達(dá)譜測序分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,存在較多表達(dá)差異基因,GO及KEGG富集分析結(jié)果提示這些差異基因參與重要的免疫過程,與人的免疫功能密切相關(guān)。
  4、Real-time PCR的驗(yàn)證結(jié)果顯示,差異基因的表達(dá)變化情況與表達(dá)譜測序結(jié)果基本一致。而Western-blotting結(jié)果顯示,部分差異基因在PBMC和CIK細(xì)胞中未檢

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