基于螢火蟲熒光素酶的凋亡檢測方法的建立及其在篩選結(jié)核分枝桿菌蛋白調(diào)控細胞凋亡中的應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）簡稱結(jié)核桿菌，是結(jié)核病的病原菌，目前世界上約1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，其中5％-10％的感染者將發(fā)展成為活動性結(jié)核病，全球每年新增結(jié)核病患者約880萬，死亡約300萬。細胞凋亡是細胞發(fā)生的一種程序性死亡，在組織分化、器官發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)等生理過程中發(fā)揮著重要作用。盡管細胞凋亡是一種正常的生理現(xiàn)象，但是異常的細胞凋亡常引起許多疾病。調(diào)節(jié)宿主細胞凋亡是結(jié)核分枝桿菌致病性的

2、一部分，影響結(jié)核分枝桿菌的生存、繁殖、擴散等過程。
　　快速準(zhǔn)確的檢測細胞凋亡是研究凋亡相關(guān)機制以及評價凋亡對疾病過程影響的基礎(chǔ)。Caspase-3的激活是細胞凋亡的重要標(biāo)志，常被應(yīng)用于凋亡檢測方法的建立。為了方便快速的檢測結(jié)核分枝桿菌蛋白對細胞凋亡的影響，本研究將caspase-3的識別序列與螢火蟲熒光素酶融合表達構(gòu)建了一個新型的caspase-3報告質(zhì)粒，用于細胞凋亡的檢測，并篩選了部分結(jié)核分枝桿菌編碼的蛋白，具體研究內(nèi)容如下

3、:
　　1.Caspase-3報告質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證
　　本研究構(gòu)建了四種caspase-3報告質(zhì)粒，將四種報告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞，在細胞凋亡陽性刺激物刺激下，四種報告質(zhì)粒熒光素酶的值明顯增加，同時熒光素酶被切割，說明報告質(zhì)粒構(gòu)建成功。細胞凋亡發(fā)生時，233-DnaE-DEVDG激活超過25倍，其對照的值處于較低水平，而另外三種報告質(zhì)粒和相應(yīng)對照的值同時升高。這些結(jié)果說明233-DnaE-DEVDG背景值低、敏感性高，更

4、適合應(yīng)用于檢測細胞凋亡。
　　2.結(jié)核分枝桿菌ESAT-6家族蛋白的篩選
　　將結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白家族真核表達質(zhì)粒、233-DnaE-DEVDG和TK共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，通過雙熒光素酶試驗檢測結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白家族成員對細胞凋亡的影響。實驗發(fā)現(xiàn)esxA、esxT和esxL能激活233-DnaE-DEVDG并呈劑量依賴性，esxC不能激活233-DnaE-DEVDG。
　　3.篩選結(jié)果的驗證
　

5、　為了驗證篩選結(jié)果的可靠性，本研究通過經(jīng)典的細胞凋亡檢測方法驗證。Caspase-3在細胞凋亡相關(guān)通路中處于中心位置，是評價細胞凋亡的核心指標(biāo)。本研究通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)esxA和esxT可以促進caspase-3的活化，陰性對照esxC不能促進caspase-3的活化;細胞凋亡檢測試劑盒染色后，通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)esxA和esxT可以上調(diào)凋亡細胞比率。
　　4.核因子-κB(NF-κB)參與esxT誘導(dǎo)的細胞

6、凋亡
　　NF-κB通路與細胞凋亡密切相關(guān)，在一定情況下，NF-κB激活是細胞凋亡所必須的。為探究NF-κB通路是否參與esxT誘導(dǎo)的細胞凋亡，本研究通過雙熒光素酶試驗檢測發(fā)現(xiàn)esxT能激活NF-κ3啟動子并呈劑量依賴性，用BAY11抑制NF-κB的激活會導(dǎo)致esxT誘導(dǎo)的細胞凋亡水平部分下降，說明NF-κB的激活參與了esxT誘導(dǎo)的細胞凋亡。NF-κB通路主要通過促進其下游的促凋亡基因表達促進細胞凋亡，為進一步尋找esxT通過N