基于基因打靶載體和昆蟲(chóng)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)hGM-CSF的研究.pdf

1、人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(human granuloeytc-macrophage colonystimulating factor，hGM-CSF)作為一種重要的具有免疫調(diào)節(jié)功能的糖蛋白，在當(dāng)前具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。如何獲得高效表達(dá)、高活性、毒副作用小的hGM-CSF是近年來(lái)基因工程研究的熱點(diǎn)。目前重組hGM-CSF已在多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，隨著重組hGM-CSF的臨床研究的日趨成熟，其應(yīng)用前景將更為廣闊。
　　 家蠶轉(zhuǎn)

2、基因的研究已經(jīng)有20多年的歷史了，具有家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。但是，外源基因的有效導(dǎo)入、整合表達(dá)水平及遺傳穩(wěn)定性上還存在很多不足。本研究將帶有以家蠶絲素重鏈基因第一外顯子及其下游部分序列和第二外顯子部分序列及其上游部分序列做為同源序列和A3啟動(dòng)子控制下的gfp報(bào)告基因以及由絲素輕鏈(fib-L）啟動(dòng)子控制下的hGM-CSF基因的打靶載體利用精子介導(dǎo)法導(dǎo)入家蠶，通過(guò)綠色熒光和分子生物學(xué)方法篩選轉(zhuǎn)基因家蠶，首次利用基因打靶技術(shù)成

3、功獲得可以正常結(jié)繭傳代的轉(zhuǎn)基因家蠶，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，hGM-CSF在每克鮮組織中的表達(dá)量為1.26 ng。同時(shí)，成功構(gòu)建了具有hGM-CSF表達(dá)元件的昆蟲(chóng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化載體PIZT-hGM-CSF，轉(zhuǎn)基因載體與輔助質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞和昆蟲(chóng)Sf-9細(xì)胞，利用博萊霉素篩選獲得持續(xù)表達(dá)hGM-CSF穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，hGM-CSF在106個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的家蠶BmN細(xì)胞和昆蟲(chóng)Sf-9細(xì)胞中的表達(dá)量分別為0.7ng和