豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)三聚體自轉運粘附素肺組織互作蛋白篩選研究.pdf

1、三聚體自轉運黏附素(Trimeric autotransporter adhesins，TAAs)是許多目前已知革蘭氏陰性菌外膜上具有的非常重要的黏附毒力蛋白，在細菌對機體的黏附過程、侵襲能力、定植作用、被膜形成、抵御血清和自凝功能中發(fā)揮非常重要的作用。黏附素通過與細胞表面基質或受體結合后啟動胞內信號級聯(lián)反應，引發(fā)機體與致病菌互作，因此細菌黏附宿主在致病菌與宿主免疫系統(tǒng)互作過程中具有重要作用。Adh為APP上新發(fā)現(xiàn)的三聚體自轉運黏附素，

2、本文對Adh基因進行肺組織文庫的酵母雙雜交篩選，并對篩選分析出的陽性蛋白進行生物信息學分析，且利用生物信息學相關分析結果討論互作可能性及預測Adh其他未知功能。主要的研究內容如下:
　　1.APP Adh基因酵母雙雜交誘餌質粒構建及鑒定
　　以NCBI公布的Adh基因序列為基礎，設計引物從APP5b型菌株中擴增Adh基因，其基因大小為1600bp左右。將Adh基因連接T克隆載體，經酶切測序鑒定正確后構建PGBKT7-Adh重

3、組誘餌質粒，該誘餌質粒經PCR鑒定和測序驗證顯示，插入的Adh基因序列無移碼突變，表明PGBKT7-Adh重組質粒構建成功。
　　首先將PGBKT7-Adh重組質粒轉化入酵母菌AH109感受態(tài)細胞中，篩選在SD/-Trp上能夠生長的酵母菌落作PCR鑒定，結果顯示1600bp左右條帶，表明PGBKT7-Adh重組質粒轉進酵母菌AH109中，成功構建含Adh基因的酵母雙雜交誘餌質粒菌。其次鑒定誘餌質粒菌的篩選及生長特性，以空載體質粒菌

4、為陰性對照，誘餌質粒經自激活驗證試驗表明轉入的誘餌重組質粒不能激活報告基因對自身無自激活現(xiàn)象，毒性驗證表明誘餌質粒菌與陰性對照生長情況一致對菌株的正常生長不產生影響，綜上結果說明誘餌質粒菌能夠用于后續(xù)篩選驗證。
　　2.肺組織文庫（大腸桿菌及酵母菌）質量鑒定
　　將保存的肺組織文庫（大腸桿菌及酵母菌）平板培養(yǎng)后，首先分別挑取LB含氨芐抗性及SD/-Leu平板上的單個菌落作PCR鑒定文庫質粒大小，結果顯示文庫條帶大部分分布于1

5、000bp左右，符合文庫片段大小要求。其次對肺組織文庫（大腸桿菌）容量進行鑒定，結果顯示5ml的菌液總庫容量為2.9×107CFU。再對肺組織文庫（酵母菌）進行滴度測定和缺陷培養(yǎng)基生長驗證，缺陷培養(yǎng)結果顯示能夠在SD/-Leu平板生長，不能在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板生長，說明表型正確;滴度結果顯示大于2×107 cfu/ml，表明文庫完整。結果表明保存的肺組織文庫（大腸桿菌和酵母菌）質量

6、較好，能夠滿足酵母雙雜交篩選條件。
　　3.APP Adh肺組織互作蛋白篩選
　　將誘餌質粒與保存的豬肺組織cDNA文庫質粒共轉化入酵母菌AH109中。根據酵母雙雜交篩選的缺陷生長及顯色原理，共轉子經SD/-Trp/-Leu平板過度后轉移至SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A平板。挑取在SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A上生長的藍色較大菌落，提取質粒后與誘餌質粒再次雜交作回復驗證表明

7、具有顯色反應。同時對質粒進行PCR及測序驗證比對。結果顯示經兩輪篩選，在SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu/-X/-A平板上共獲得藍色較大酵母菌落13個，提取質粒PCR結果顯示大部分質粒位于500bp左右，測序驗證后經NCBI比對mRNA編碼區(qū)分析結果顯示篩選出四個陽性蛋白，分別為鋅指蛋白，含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶，HLA-Ⅱ類分子的調節(jié)分子，支鏈氨基酸轉氨酶1。然后分析了四種蛋白的生物學特性及功能位點，