蘋(píng)果冷脅迫下差異表達(dá)基因的篩選及新抗逆基因MdTLP7的功能鑒定.pdf

1、植物在其整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育的生命周期中面臨著各種不利的外部環(huán)境，其中，低溫是限制植物生長(zhǎng)與分布的重要的環(huán)境因素之一，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。利用基因工程對(duì)作物進(jìn)行遺傳改良提高其抗逆性，是保障作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和安全生產(chǎn)的有效途徑，大量植物抗逆功能基因的分離和鑒定則為基因工程遺傳改良提供了目的基因。本研究選擇較耐寒的蘋(píng)果砧木品種Mailing26(M.26)，利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)冷處理的幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出表達(dá)量顯著變化的基因

2、，對(duì)這些基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和注釋?zhuān)瑥闹袑ふ倚碌目购?，為深入闡明植物耐寒性分子機(jī)理提供更多的依據(jù)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)在確定M.26抗寒性敏感時(shí)間點(diǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)冷脅迫處理后的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。電導(dǎo)率和丙二醛含量分別是檢測(cè)細(xì)胞膜受損程度和衡量膜脂過(guò)氧化程度的指標(biāo)。測(cè)定冷處理幼苗葉片的電導(dǎo)率與丙二醛含量，對(duì)比M.26與蘋(píng)果栽培品種Gala抗寒性的差異，確定1h和6h可作為M.26抗寒性敏感時(shí)間點(diǎn)。4℃冷處理M.26葉

3、片后，提取RNA用于Solexa測(cè)序，0h、1h和6h冷處理的三個(gè)樣品分別獲得318576、300676和640732個(gè)特異性標(biāo)簽。排除假陽(yáng)性標(biāo)簽、比對(duì)蘋(píng)果基因組并拼接組裝后得到了14219、11176和16116個(gè)有效基因。
　　(2)表達(dá)譜中差異表達(dá)的基因篩選及功能分析。設(shè)置差異倍數(shù)大于等于4(| log2差異倍數(shù)|=2)為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，1h與0h相比，得到139個(gè)上調(diào)基因和1499個(gè)下調(diào)的基因;6h與1h相比，獲得10

4、85個(gè)上調(diào)基因和381個(gè)下調(diào)基因，其中約40％的差異基因?yàn)槲粗?。GO功能分類(lèi)和KEGG Pathway分析表明差異基因參與多種通路，涉及16類(lèi)細(xì)胞組分的變化包括質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等，10類(lèi)分子功能的變化包括轉(zhuǎn)錄因子、抗氧化物、信號(hào)傳感器、酶調(diào)節(jié)物等，13類(lèi)生化途徑包括代謝調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)、基因表達(dá)等，這些組分及調(diào)節(jié)的生化反應(yīng)在植物適應(yīng)冷脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

5、分析驗(yàn)證表達(dá)譜的可靠性。隨機(jī)挑選6個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因，設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)M.26葉片用前述相同的方法進(jìn)行冷脅迫處理，提取RNA后，利用qRT-PCR檢測(cè)這11個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量并與表達(dá)譜結(jié)果對(duì)比，qRT-PCR所得結(jié)果與表達(dá)譜中11個(gè)基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致，表明表達(dá)譜的結(jié)果是可靠的。
　　(4)克隆得到新抗逆基因，分析其編碼蛋白MdTLP7(Tubby-like protein7)的結(jié)構(gòu)特征。從冷脅迫差異基因表達(dá)譜中，我們

6、發(fā)現(xiàn)了一個(gè)動(dòng)物肥胖基因（Tubby）同源物，該基因的表達(dá)量在4℃冷處理6h時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，暗示著它在植物非生物脅迫中起重要作用。從蘋(píng)果的cDNA文庫(kù)中我們克隆得到了該基因，其編碼區(qū)長(zhǎng)度1245-bp，編碼含415個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，我們稱(chēng)之為MdTLP7。與動(dòng)物TLP蛋白只有Tubby結(jié)構(gòu)域不同，MdTLP7從N-端到C-端由前導(dǎo)肽、F-box結(jié)構(gòu)域和Tubby結(jié)構(gòu)域組成。
　　(5) MdTLP7抗逆功能鑒定。構(gòu)建原核表達(dá)載體，將

7、MdTLP7轉(zhuǎn)入大腸桿菌。在固體和液體培養(yǎng)下對(duì)大腸桿菌細(xì)胞分別進(jìn)行4℃、50℃、0.5M NaCl和0.5M KCl脅迫處理，檢測(cè)MdTLP7重組表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，上述脅迫條件下，包含MdTLP7重組質(zhì)粒的菌株其存活率和生長(zhǎng)速率都明顯高于對(duì)照菌株，表明MdTLP7的表達(dá)顯著增強(qiáng)了原核細(xì)胞抵抗鹽與溫度脅迫的能力。
　　(6) MdTLP7功能區(qū)域分析。根據(jù)MdTLP7的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分別從N-末端和C-末端設(shè)計(jì)系列缺失突變

8、體，重組表達(dá)后結(jié)果表明，缺失前導(dǎo)肽與F-box結(jié)構(gòu)域后，MdTLP7抗逆功能與野生型相比沒(méi)有明顯變化，而Tubby結(jié)構(gòu)域的缺失顯著降低了MdTLP7的抗逆能力，在120-415氨基酸片段的Tubby結(jié)構(gòu)域中，120-310氨基酸片段對(duì)MdTLP7的抗逆能力作用最重要。三維模擬Tubby結(jié)構(gòu)域，由一個(gè)β桶包圍中心的α螺旋組成，120-310氨基酸片段組成β桶部分結(jié)構(gòu)，說(shuō)明Tubby結(jié)構(gòu)域的β桶結(jié)構(gòu)對(duì)該蛋白的抗逆功能起關(guān)鍵作用，而C-末端的