泥鰍生長激素基因在畢赤酵母中的表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、生長激素(growth hormone,GH)是所有脊椎動物包括魚類維持正常的生長和發(fā)育所必需的一種單鏈多肽激素,在機體的生長和發(fā)育過程中起著重要作用。具有促進脂類降解,加速蛋白合成等作用。天然魚體中GH含量低,許多研究證實,重組生長激素具有天然生長激素的功能,因此,為了得到大量具有生物活性的重組生長激素,本論文成功將泥鰍生長激素基因(Misgurnus Anguillicaudatus GH,MaGH)克隆入pPIC9K表達載體,并實

2、現(xiàn)在畢赤酵母(Pichiapastoris)的分泌表達。
   以成體泥鰍腦垂體中提取的總RNA為模板,用RT-PCR方法擴增并克隆cDNA,根據(jù)MaGH兩端序列改造,設計一對特異性引物(上游引物加入EcoRⅠ酶切位點,下游引物加入NotⅠ酶切位點)擴增了泥鰍的GH成熟肽cDNA。將獲得的泥鰍生長激素基因表達片段,經(jīng)酶切后連接到能夠獲得高拷貝數(shù),并含有酵母相應信號肽的pPIC9K表達載體中,轉化大腸桿菌DH5α,獲得重組pPIC

3、9K-MaGH酵母高效表達載體。用質粒PCR方法篩選陽性克隆,用EcoRⅠ和NotⅠ酶切鑒定重組質粒。測序表明MaGH正確插入α分泌信號開放讀碼框的下游。再將獲得的pPIC9K-MaGH重組子線性化處理,經(jīng)氯化鋰轉化組氨酸缺陷型畢赤巴斯德酵母GS115,轉化后的酵母菌株經(jīng)MD培養(yǎng)基篩選陽性重組子,提取轉化子基因組DNA,用基因組PCR鑒定重組菌株。將這些克隆用誘導表達培養(yǎng)基BMMY誘導,取上清進行SDS-PAGE分析,結果表明,在上清中

4、檢測到MaGH,誘導4天時表達量最高,占上清總蛋白的53%,最高表達量為300mg/L。不同的pH值實驗表明,最適pH值為6.0。將重組工程菌投喂泥鰍魚苗,實驗魚的體重和體長明顯高于對照組,達到顯著性差異,實驗初步顯示分泌表達的MaGH具有促進泥鰍生長作用。
   本研究克隆到了泥鰍GH基因成熟肽的cDNA序列,并成功構建了真核表達載體,實現(xiàn)了泥鰍重組GH蛋白的高效表達,為進一步開展其應用和生物活性檢測分析及研制新型魚類生長飼料

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