轉(zhuǎn)自源生長激素基因唐魚的研究.pdf

1、唐魚(Tanichthys albonubes)又名白云金絲魚，屬鯉形目，鯉科，魚丹亞科，唐魚屬，為我國特有種。由于唐魚具有和斑馬魚等模式生物相似的特征，如個體小、性成熟期與孵化期短、多次產(chǎn)卵、胚體透明等，適合于作為轉(zhuǎn)基因研究的受體魚。近年來在轉(zhuǎn)基因魚研究中提出了轉(zhuǎn)自源基因的概念，有多位學(xué)者開始了自源基因的轉(zhuǎn)化研究并取得進展。本實驗克隆了唐魚生長激素基因，利用本實驗室已分離到的具有強啟動活性的β-actin基因啟動子，構(gòu)建了自源生長激素

2、基因表達載體，采用顯微注射方法，獲得生長快、個體大的的轉(zhuǎn)基因唐魚。主要研究內(nèi)容如下： 1.采用RT-PCR和RACE技術(shù)分離唐魚生長激素基因(GH)全長cDNA序列，同時利用PCR克隆了唐魚生長激素基因的基因組(gDNA)序列。序列分析表明：唐魚GH cDNA的5’非編碼區(qū)為64 bp，3'編碼區(qū)448bp，開放閱讀框(ORF)633bp，共編碼210個氨基酸，包括22個氨基酸的信號肽和188個氨基酸的成熟肽。應(yīng)用MEGA 3.

3、1軟件進行序列同源性比較分析的結(jié)果顯示，唐魚GH cDNA所編碼的氨基酸序列與近緣魚種(草魚、青魚、鳙魚、鯉魚、斑馬魚等)的生長激素氨基酸序列有很高的同源性，其中與草魚和鳙魚的同源性高達98％。該研究獲得的唐魚生長激素基因的gDNA序列共有1403 bp，包括4個外顯子和3個內(nèi)含子，外顯子大小分別150 bp、117 bp、162 bp、204 bp。三個內(nèi)含子都以GT開頭，AG結(jié)尾，符合GT-AG法則。根據(jù)GH編碼氨基酸序列對分屬14

4、個科的25個物種，包括人和其它哺乳動物(牛、鼠、豬)及鳥類等進行分子進化樹聚類分析，結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化特征分類的進化地位基本一致。 2.RT-PCR和高保真PCR分別克隆唐魚β-actin基因cDNA和gDNA序列。gDNA測序結(jié)果表明：唐魚β-actin基因由五個外顯子和四個內(nèi)含子組成，外顯子長度分別為123bp、240bp、439bp、182bp、144bp。β-actin基因cDNA全長1787bp，編碼了375

5、個氨基酸，與其他物種actin家族相比具有高度保守性。唐魚β-actin編碼的氨基酸與青魚、鯉魚、草魚及斑馬魚同源性均為99.7％，與鯪魚的同源性為99.5％，與羅非魚、斜帶石斑魚、人及家鼠的同源性均為98.9％。 3.構(gòu)建了轉(zhuǎn)自源生長激素基因表達載體pTLA-GH。pTLA-DsRed是本實驗室前期完成構(gòu)建的一個紅色熒光蛋白基因表達載體，是將唐魚β-actin基因的啟動子定向插入到不含啟動子的紅色熒光表達載體pDsRed2-1

6、而構(gòu)建的表達載體，并已證實該啟動子具有強驅(qū)動活性。將本實驗所克隆的唐魚生長激素基因的開放閱讀框(ORF)替換pTLA-DsRed中的DsRed基因從而構(gòu)建含唐魚β-actin基因的啟動子和唐魚生長激素基因ORF(含有編碼信號肽的核苷酸序列)的表達載體pTLA-GH。 4.轉(zhuǎn)自源生長激素基因唐魚的獲得與檢測。表達載體pTLA-GH，經(jīng)線性化后采用顯微注射的方法轉(zhuǎn)入唐魚的受精卵中。實驗共注射了204粒受精卵，其中有85粒卵孵化出膜，

7、培育成活的轉(zhuǎn)生長激素基因唐魚共有37尾。實驗魚養(yǎng)殖100d，實驗組最大個體體重1.120g，是對照組最大個體體重的2.1倍，是對照組平均體重的3.0倍。提取部分轉(zhuǎn)基因唐魚的內(nèi)臟、眼睛、鰭條和肌肉進行PCR檢測，在超大型的唐魚中均可檢測到轉(zhuǎn)植基因。實驗還采用了共注射方法，將生長激素表達載體pTLA-GH和紅色熒光蛋白表達載體p17LA-DsRcd共注射到唐魚的受精卵中。培育86 d，實驗組最大個體體重是對照組最大個體的1.7倍，是對照組平

8、均體重的2.5倍。實驗組大型個體中均可見紅色熒光蛋白表達且PCR均可檢測到pTLA-GH和pTLA-DsRcd基因，說明共注射可提高轉(zhuǎn)植基因的檢測效率。 5.采用高保真PCR技術(shù)從尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)基因組中分離到具有轉(zhuǎn)錄活性的β-肌動蛋白(β-actin)基因啟動調(diào)控序列。序列分析顯示該片段包括長為1 643 bp的β-actin基因5’端側(cè)翼區(qū)的啟動調(diào)控區(qū)和90 bp的部分轉(zhuǎn)錄區(qū)序列。將尼

9、羅羅非魚β-actin基因的啟動調(diào)控區(qū)定向克隆到不含啟動子的紅色熒光表達載體pDsRed2-1中，構(gòu)建了紅色熒光表達載體。該載體經(jīng)EcoR I線性化后，顯微注射到唐魚(Tanichthys albonubes)的受精卵中，利用熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白基因(DsRed2)在唐魚中的表達。結(jié)果表明，在熒光顯微鏡下以及普通解剖鏡下均可觀察到紅色熒光，說明本實驗分離到的羅非魚β-actin基因啟動子序列具有有效的驅(qū)動功能。這為下一步轉(zhuǎn)自源生長