水稻Rho GTP酶激活蛋白編碼基因OsRhoGAP2功能的初步鑒定.pdf

1、已有研究顯示，植物RhoGAP/RopGAP可能通過調(diào)節(jié)Rop蛋白來(lái)參與多種生物學(xué)過程。本實(shí)驗(yàn)室采用酵母雙雜交技術(shù)，從水稻幼穗中分離得到一個(gè)與水稻Rho/Rop蛋白OsRacD相互作用蛋白的編碼基因，命名為OsRhoGAP2，目前對(duì)該基因的研究尚未見報(bào)道。本研究從序列特征、亞細(xì)胞定位、激素對(duì)該基因表達(dá)的影響、啟動(dòng)子的克隆和序列缺失、過表達(dá)和RNA干擾技術(shù)鑒定該基因功能開展一系列的研究，旨在確定該基因的調(diào)控機(jī)制及其在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，

2、為研究OsRacD與OsRhoGAP2的相互作用和功能聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。
　　采用生物信息學(xué)分析，對(duì)OsRhoGAP2的基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位等特性進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，OsRhoGAP2位于2號(hào)染色體，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。該基因cDNA全長(zhǎng)1552bp，含有一個(gè)1320bp的讀碼框，編碼439個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子。蛋白序列中包括RhoGAP和CRIB保守結(jié)構(gòu)域，屬親水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺

3、旋、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則的螺旋組成。
　　為研究OsRhoGAP2的亞細(xì)胞定位，采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了與綠色熒光蛋白(eGFP)融合的pCAMBIA1302-OsRhoGAP2-eGFP載體，使其受控于CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子。采用農(nóng)桿菌侵染的方法，檢測(cè)融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的分布，發(fā)現(xiàn)OsRhoGAP2-eGFP融合蛋白主要定位在細(xì)胞膜上。
　　為研究OsRhoGAP2基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，通過水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索和比對(duì)

4、，確定了OsRhoGAP2基因翻譯起點(diǎn)上游1912bp的啟動(dòng)子序列，采用植物啟動(dòng)子順式元件數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)啟動(dòng)子的元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)可能受到激素、高鹽和干旱等非生物脅迫的調(diào)控。進(jìn)而采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)了IAA、6-BA、GA、SA、MeJA、ABA等6種植物激素，以及高鹽、干旱等非生物脅迫對(duì)該基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)該基因在IAA、6-BA、GA、SA處理下，表達(dá)量均有2倍以上的提高。在MeJA和ABA激素的處理下

5、，OsRhoGAP2基因的表達(dá)量變化幅度在2倍以內(nèi);而在干旱和鹽等非生物脅迫處理過程中發(fā)現(xiàn)，OsRhoGAP2基因的表達(dá)量都在3h時(shí)達(dá)到最大值，然后逐漸恢復(fù)到正常水平。兩類實(shí)驗(yàn)的共同提示，OsRhoGAP2的表達(dá)受到多種信號(hào)的調(diào)控。為進(jìn)一步研究其表達(dá)調(diào)控機(jī)制，通過PCR介導(dǎo)的方法，克隆了該基因的啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行了序列缺失，分別構(gòu)建了6個(gè)與GUS報(bào)告基因融合的系列啟動(dòng)子缺失植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定

6、基礎(chǔ)。
　　為了鑒定OsRhoGAP2基因的功能，采用了功能獲得和功能缺失兩種策略，分別構(gòu)建了OsRhoGAP2基因的過表達(dá)植物載體以及RNA干擾植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻，獲得了19棵T0代陽(yáng)性過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。分子檢測(cè)顯示，重組基因已經(jīng)整合到水稻基因組中，并實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)。OsRhoGAP2基因干擾轉(zhuǎn)基因植株的篩選正在進(jìn)行當(dāng)中。
　　本文通過一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)OsRhoGAP2基因的序列特征、表達(dá)及調(diào)控機(jī)制以及