應(yīng)用基因芯片篩選植物激活蛋白處理水稻相關(guān)差異基因及其驗證.pdf

1、植物激活蛋白是從交鏈孢真菌（Alternaria.spp）中提取分離的一種新型多功能蛋白，該蛋白本身無毒，能提高植物的過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和脯氨酸的含量，通過激活植物體內(nèi)分子免疫系統(tǒng)，提高植物自身免疫力，促進(jìn)植物根莖葉生長，從而達(dá)到提高作物產(chǎn)量的目的，其潛在的基因水平的機制尚不清楚。 基因芯片(Gene chip)又稱DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA microarray), 其中基因表達(dá)譜芯片(Gen

2、e expression profiling)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因芯片。表達(dá)譜芯片可以分析不同來源的mRNA轉(zhuǎn)錄雜交的差異，通過分析表達(dá)譜基因芯片，可從整體水平研究代謝機制，認(rèn)識基因相互之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)重要基因。傳統(tǒng)的RNA方法學(xué)，如Northern雜交分析，一次只能研究一種基因，成本高，效率低；而新興的基因芯片技術(shù)，提供了一種基因差異表達(dá)的高通量研究工具。 本實驗研究目的是用2 mg /ml植物激活蛋白處理水稻幼苗，應(yīng)

3、用基因表達(dá)譜檢測相關(guān)差異基因的表達(dá)，建立植物激活蛋白誘導(dǎo)水稻相關(guān)基因表達(dá)譜，為深入揭示該激活蛋白的作用機制研究提供依據(jù)。研究方法：提取處理組和對照組的RNA，純化，逆轉(zhuǎn)錄，用Cy5和Cy3分別標(biāo)記cDNA，將兩種熒光探針混合，與載有10 368位點的水稻表達(dá)譜cDNA基因芯片進(jìn)行雜交并用芯片掃描系統(tǒng)進(jìn)行掃描，通過Cy5與Cy3信號強度比值的計算得到差異表達(dá)基因，對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用RT-PCR技術(shù)對10個差異表達(dá)基因進(jìn)

4、行驗證，并對10個差異表達(dá)基因的時序變化情況進(jìn)行初步研究。研究結(jié)果：實驗設(shè)計兩次重復(fù)，其中芯片1得到差異表達(dá)基因256條，其中表達(dá)上調(diào)的50條；芯片2得到差異表達(dá)基因499條，其中表達(dá)上調(diào)的有98條，在兩張芯片中都差異表達(dá)基因97條，其中上調(diào)基因4條，下調(diào)基因93條。RT-PCR驗證結(jié)果顯示：在兩張芯片中都表現(xiàn)為上調(diào)的基因為陽性與芯片結(jié)果一致；在單張芯片中上調(diào)的基因表現(xiàn)為上調(diào)與芯片結(jié)果不完全一致。結(jié)論：1) 本實驗成功地將基因芯片技術(shù)應(yīng)

5、用于激活蛋白處理水稻差異表達(dá)基因的篩選中，得到兩張芯片中共同差異表達(dá)的基因97條，其中4條基因呈上調(diào)表達(dá)，93條基因呈下調(diào)表達(dá)；2) 通過對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及歸類，這些基因按功能分類可分為參與包括光合作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)調(diào)控、代謝、發(fā)育相關(guān)、核糖體蛋白、轉(zhuǎn)運類蛋白等幾大類別及一些功能未知基因；3) 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對10條差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示：在兩張芯片中都表現(xiàn)為上調(diào)的基因為陽性與芯片結(jié)果一致；在單張

6、芯片中上調(diào)的基因表現(xiàn)為假陰性；4) 將基因芯片技術(shù)引入激活蛋白處理水稻差異表達(dá)基因的篩選的研究中是可行的，并且有巨大的應(yīng)用前景。勿庸置疑，運用基因芯片篩選差異表達(dá)基因仍存在假陰性和假陽性等缺點，畢竟芯片的研發(fā)才經(jīng)歷了短短的十余年，并且國內(nèi)在這方面的研發(fā)也僅是起步而已。本次研究中，8條在單張芯片中差異表達(dá)的上調(diào)基因也不完全符合RT-PCR的鑒定結(jié)果。基因芯片技術(shù)是一個有效的高通量基因表達(dá)分析手段，但芯片實驗的重復(fù)性并不非常理想，需要進(jìn)行重