一種基于熒光素酶報(bào)告基因的體外抗病毒藥物篩選方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、中草藥價(jià)格低廉、副作用小、抗病毒譜廣，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，諸多優(yōu)點(diǎn)使得中藥抗病毒研究成為世界研究熱點(diǎn)之一。桿狀病毒作為模式相對(duì)簡(jiǎn)單的DNA病毒代表，它的研究對(duì)其他抗病毒研究有一定的借鑒意義，并且該病毒對(duì)哺乳動(dòng)物安全，便于操作。本課題利用我國(guó)豐富的中藥資源和桿狀病毒，建立一種新的抗病毒藥物篩選方法，利用Bac-to-Bac策略構(gòu)建一個(gè)重組桿狀病毒，里面插入熒光素酶報(bào)告基因，隨著病毒的復(fù)制增殖，熒光素酶得以表達(dá)，如此一來(lái)，通過(guò)測(cè)定熒光素酶的

2、表達(dá)情況就可以監(jiān)測(cè)病毒的增殖情況，因而可以從病毒增殖的角度直接評(píng)判藥物的抗病毒活性。
　　 本研究成功構(gòu)建了重組桿狀病毒，通過(guò)PCR鑒定表明熒光素酶報(bào)告基因已成功插入病毒基因組。采用熒光定量PCR方法測(cè)定重組桿狀病毒的滴度，該方法耗時(shí)較短、操作簡(jiǎn)單，可檢測(cè)低到只有幾個(gè)拷貝的病毒基因組，具有較高的靈敏度，重復(fù)測(cè)定的RSD均小于4％，具有良好的重復(fù)性。對(duì)重組桿狀病毒和野生桿狀病毒的增殖活力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者無(wú)顯著性差異，所以重組桿狀

3、病毒可用作后續(xù)抗病毒實(shí)驗(yàn)的病毒株。對(duì)新建立的體外抗病毒藥物篩選方法的測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，確定病毒吸附時(shí)間為2 h、細(xì)胞鋪板密度為104個(gè)/孔、病毒感染復(fù)數(shù)為1、病毒感染4天后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)最合適。采用MTT法對(duì)黃連素、姜黃素、蟲(chóng)草素、黃芩苷、大黃酸、青蒿素和苦參堿七種中藥成分進(jìn)行藥物安全濃度的測(cè)定，確定其最大無(wú)毒濃度分別是1.56 mg/L、6.25 mg/L、5 mg/L、12.5 mg/L、3.125 mg/L、12.5 mg/

4、L、100 mg/L。在安全濃度之下進(jìn)行體外抗病毒實(shí)驗(yàn)，采用藥物病毒相互作用一段時(shí)間后同時(shí)加入、先加藥物后加病毒、先加病毒后加藥物三種加藥方式進(jìn)行，分別研究藥物對(duì)病毒的直接殺滅、抑制病毒的吸附注入、抑制病毒的復(fù)制三種作用。結(jié)果表明，七種中藥成分均有抑制病毒復(fù)制的作用，但姜黃素抑制效果最好，最高可達(dá)54％，只有黃連素、姜黃素和青蒿素有直接殺滅病毒活性，但效果不佳，對(duì)病毒的抑制率大概在10％～30％，蟲(chóng)草素和苦參堿可以抑制病毒的吸附注入，但