常見人皰疹病毒PCR—基因芯片技術(shù)的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、臨床常見的人皰疹病毒有單純皰疹病毒1型和2型(HSV-1、HSV-2)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、愛潑斯坦一馬爾病毒(EBV)、人巨細(xì)胞病毒(CMv)和人類皰疹病毒6型(HHV-6A、HHV-6B)等, 由人皰疹病毒感染引起的發(fā)熱、黃疸、肝脾腫大、腦炎或腦膜炎等,因癥狀和體征無特異性,其早期診斷和及時治療需依賴于實驗室的診斷.在本研究中,我們在人皰疹病毒的DNA多聚酶基因區(qū)設(shè)計引物和寡核苷酸探針,并將探針固定于經(jīng)特定修飾的玻片上,制

2、成基因芯片,最終建立了PCR-基因芯片技術(shù)快速并行檢測HSV-1、HSV-2、VZV、EBV、CMV、HHV-6A和HHV-6B等多種人皰疹病毒,并對臨床血、腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測,取得良好結(jié)果. 本研究分為兩部分:第一部分,常見人皰疹病毒PCR-基因芯片技術(shù)的建立;第二部分,常見人皰疹病毒PCR-基因芯片技術(shù)的臨床應(yīng)用研究. 第一部分 常見人皰疹病毒PCR.基因芯片技術(shù)的建立方法： 以人皰疹病毒DNA多聚酶

3、基因為靶序列,設(shè)計引物,用于同時擴(kuò)增單純皰疹病毒1型和2型(HSV-1、HSV-2)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、愛潑斯坦一馬爾病毒(EBV)、人巨細(xì)胞病毒(CMv)和人類皰疹病毒6型(HHV-6A、HHV-6B)等多種人皰疹病毒;在各擴(kuò)增序列內(nèi)設(shè)計特異寡核苷酸探針,并將探針固定于經(jīng)特定修飾的玻片上,制成基因芯片;標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增并CY5熒光標(biāo)記后,與基因芯片進(jìn)行雜交分型,洗脫后激光掃描讀片. 結(jié)果：7種人皰疹病毒經(jīng)PCR擴(kuò)增

4、后產(chǎn)物為224-252bp (HSV-1、HSV-2各232 bp,VZV 224 bp,EBV 227bp,CMV 235bp,HHV-6A、HHV-6B各252bp),與基因芯片上相應(yīng)的探針位點(diǎn)雜交后可鑒別分型,無交叉雜交現(xiàn)象,且各相同探針位點(diǎn)的雜交信號強(qiáng)度無明顯差異.金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙肝病毒、新型隱球菌、白色念珠菌及人基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增及凝膠電泳后,均未見相應(yīng)長度片段的條帶,與芯片亦無雜交現(xiàn)象.將各標(biāo)準(zhǔn)病毒株的質(zhì)

5、粒經(jīng)梯度稀釋至10<'0>～10<'7>拷貝/μl后作為模板,進(jìn)行PCR.基因芯片技術(shù)檢測,其最低檢出濃度為:10<'1>拷貝/μl. 結(jié)論：建立的多重PCR.基因芯片技術(shù),可同時擴(kuò)增并鑒別分型7種人皰疹病毒,且特異敏感、快速簡便,可望為臨床早期、準(zhǔn)確診斷人皰疹病毒的感染提供有效方法. 第二部分 常見人皰疹病毒PCR-基因芯片技術(shù)的臨床應(yīng)用研究方法:對132例臨床擬診為病毒感染患兒的血標(biāo)本,以及6l例擬診為病毒性

6、腦炎、腦膜炎患兒的腦脊液標(biāo)本,進(jìn)行PCR-基因芯片雜交檢測,同時用TaqMan熒光定量PCR.法分別檢測標(biāo)本中HSV-1、HSV-2、EBV和CMV;并將部分陽性標(biāo)本經(jīng)分子克隆后測序.對照組為35例正常健康體檢兒童的外周血和30份非病毒感染的腦脊液標(biāo)本(腦腫瘤8份,化膿性腦膜炎22份). 結(jié)果： 1、在132例血標(biāo)本中,共檢出49例陽性標(biāo)本,其中HSV-11例,HSV-21例,EBV 16例,CMV 22例、HHV-6A

7、l例,HHV-6B 3例,HSV-2/CMV混合感染1例,VZV/CMV 1例,EBWCMV 2例,EBV/HHV-6B 1例; 2、在61例腦脊液標(biāo)本中,共檢出6例陽性標(biāo)本,其中HSV-1 1例,HSV-22例,EBV 1例,HSV-2/CMV混合感染1例,EBV/HHV-6B1例; 3、與TaqMan熒光定量PCR法比較,PCR-基因芯片技術(shù)檢測血、腦脊液標(biāo)本中HSV-1、HSV-2、EBV和CMV等4種病毒的敏感度

8、和特異度分別為96.2﹪和99.3﹪;PCR.基因芯片檢測VZV、HHV-6A、HHV-6B陽性的7份標(biāo)本,經(jīng)分子克隆后測序,與基因庫中相應(yīng)病毒序列比較,其同源性均大于98﹪.35例正常健康兒童的血標(biāo)本和30例非病毒感染的腦脊液標(biāo)本7種人皰疹病毒DNA檢測均為陰性. 4、多數(shù)病例臨床診斷或癥狀支持PCR一基因芯片檢測結(jié)果,部分病因或診斷不明確的病例(如肝功能損害原因待查、黃疸原因待查等),PCR-基因芯片技術(shù)則可為其病因的明確提