家蠶中腸上皮細(xì)胞的增殖與分化——家蠶中腸干細(xì)胞的初步識別和鑒定.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細(xì)胞群體,目前針對昆蟲干細(xì)胞的研究,是生物學(xué)領(lǐng)域的熱點之一.腸道易受到各種損傷因子的侵襲,為使生命及新陳代謝過程有序進(jìn)行,中腸組織內(nèi)的細(xì)胞需要發(fā)生持續(xù)不斷地更替,該過程主要依賴位于中腸上皮層內(nèi)中腸干細(xì)胞(intestinalstemcell,ISC)的自我更新和增殖分化。解析中腸組織結(jié)構(gòu)和鑒定中腸干細(xì)胞,是研究中腸干細(xì)胞維持及分化調(diào)節(jié)機制的基礎(chǔ),進(jìn)而對揭示昆蟲生長及變態(tài)發(fā)育和代謝調(diào)控機理

2、有重要意義,同時也為脊椎動物中腸干細(xì)胞的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。
　　 家蠶屬于完全變態(tài)昆蟲,是鱗翅目類昆蟲的典型代表,蠶的細(xì)胞遺傳和連鎖分析等研究較為深入,但對其中腸干細(xì)胞的研究目前還鮮有報道。家蠶的中腸上皮層組織在每個齡期蛻皮前都要發(fā)生大規(guī)模的更新,同時伴有組織重構(gòu),家蠶中腸干細(xì)胞直接參與該過程。
　　 本文觀察和分析了家蠶中腸在不同齡期的組織結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化,并通過免疫熒光的方法檢測家蠶中腸上皮細(xì)胞的增殖和有絲分裂,主

3、要研究結(jié)果如下:
　　 1,形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)觀察家蠶中腸組織結(jié)構(gòu)在其生長發(fā)育及變態(tài)過程中的動態(tài)變化
　　 家蠶各齡期的中腸組織經(jīng)改良bouin液進(jìn)行固定,石蠟包埋并連續(xù)切片后,用常規(guī)H&E(hematoxylin-eosinstaining)病理染色法系統(tǒng)性地觀察家蠶幼蟲及變態(tài)發(fā)育階段的中腸組織結(jié)構(gòu)變化。統(tǒng)計分析各齡期內(nèi)盛食期、眠前和眠期三個時間點的中腸橫切面大小變化的結(jié)果表明,幼蟲1、2、3、4齡期內(nèi)的中腸橫切面大小呈逐

4、漸增加的趨勢,并且眠前和眠期中腸的橫切面顯著高于盛食期(p＜0.05),同時發(fā)現(xiàn)位于基底膜處的小細(xì)胞在每次經(jīng)歷蛻皮之前會明顯增多。5齡家蠶的中腸組織的結(jié)構(gòu)變化與之前齡期有所不同,起蠶至4天整個中腸組織橫切面顯著增大(p＜0.001),進(jìn)入5齡末期的中腸發(fā)生明顯皺縮,橫切面顯著減小(p＜0.001)。
　　 進(jìn)入變態(tài)發(fā)育時期中腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)由幼蟲時期長圓筒狀逐漸萎縮變成略顯扁平的橢圓形,幼蟲的中腸組織開始出現(xiàn)大規(guī)模退化,并形成黃體(

5、yellowbody,YB)排入腸腔,同時形成新的蛹.成蟲中腸上皮層組織。
　　 利用DAPI染色技術(shù)統(tǒng)計分析1、2齡期各時間點內(nèi)中腸細(xì)胞總數(shù)和三種類型細(xì)胞數(shù)目的變化情況,結(jié)果顯示各種類型中腸細(xì)胞總數(shù)及各種類型的細(xì)胞數(shù)隨著蠶體的生長發(fā)育呈顯著增加的趨勢(p＜0.05),其中眠前和眠期階段位于基底膜的小細(xì)胞在中腸細(xì)胞總數(shù)中的百分比顯著高于其他時間點(p＜0.05)。
　　 2,分子標(biāo)記利用BrdU和PHH3標(biāo)記中腸內(nèi)發(fā)生增

6、殖的細(xì)胞
　　 本實驗將家蠶中腸經(jīng)常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片后,通過BrdU和PHH3兩種抗體的免疫熒光雙重標(biāo)記,找到家蠶中腸上皮層中發(fā)生增殖的細(xì)胞,并對不同齡期所發(fā)生的增殖細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明家蠶在眠前階段的BrdU和PHH3標(biāo)記陽性率都顯著高于盛食期(p＜0.05),家蠶中腸內(nèi)一些大細(xì)胞和小細(xì)胞能被BrdU不同程度的標(biāo)記,而有絲分裂的常用檢測物PHH3僅能標(biāo)記位于上皮細(xì)胞層基底膜的小細(xì)胞。幼蟲和蛹期中腸上皮細(xì)胞的BrdU

7、陽性標(biāo)記率呈顯著性差異(p=0.027),蛹期中腸的生命活動和上皮細(xì)胞更新速度都比幼蟲時期緩慢得多。
　　 3,BrdU滯留標(biāo)記
　　 本實驗采用經(jīng)典的BrdU滯留標(biāo)記實驗(BrdUlabelretention)初步識別家蠶中腸內(nèi)可能存在的干性細(xì)胞。通過對四齡家蠶三次間歇性注射BrdU(15ug),利用其標(biāo)記滯留細(xì)胞的方法,研究家蠶中腸上皮細(xì)胞層中可能存在的干性細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)及分布特點。統(tǒng)計分析BrdU滯留標(biāo)記陽性率的不