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文檔簡介
1、炭疽屬于造成死亡率很高的一類急性的人畜共患傳染病。炭疽桿菌常常被用作生化武器,對(duì)人類生存和生命安全存在威脅,因此炭疽桿菌的研究仍然是當(dāng)今世界面臨的一項(xiàng)重要課題。
甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(GNMT, EC2.1.1.20)是一種在自然界原核和真核生物中都豐富存在的酶,是氨基酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶,能催化甘氨酸引入甲基轉(zhuǎn)化為肌氨酸,并調(diào)控機(jī)體內(nèi)s-腺苷高半胱氨酸和肌氨酸的比率,在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用;目前為止,甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)
2、構(gòu)只有人和鼠的被解析出來,對(duì)其他物種的GNMT結(jié)構(gòu)還不了解不足,因此對(duì)炭疽桿菌的該酶晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,能夠使我們更全面、更深入的了解該酶的功能和作用機(jī)制,為藥物設(shè)計(jì)等應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶(GalE, EC5.1.3.2)是生命體內(nèi)另一具重要功能的酶,同樣廣泛分布于各種各樣的生物體內(nèi),它是葡萄糖與半乳糖之間轉(zhuǎn)化的樞紐,在半乳糖的代謝中其著至關(guān)重要的作用;目前,GalE晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過從人、大腸桿菌、布氏
3、錐蟲等物種該酶蛋白組研究中獲得,為人類揭開該酶功能和結(jié)構(gòu)機(jī)理提供了鑰匙,但是,不同的物種因其生存環(huán)境不同和自然的選擇作用,其GalE結(jié)構(gòu)存在或多或少差異,炭疽桿菌被人類看作一類高致病菌,研究其GalE結(jié)構(gòu)并功能特點(diǎn),可以使我們更加深入了解其功能發(fā)揮原理,為藥物之新創(chuàng)和疾病之診預(yù)提供方向。
本文根據(jù)KEGG(the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)Database中炭疽桿菌GNMT
4、基因序列(登錄號(hào)為BAS3318)和GalE基因序列(登錄號(hào)為BAS1093),設(shè)計(jì)特異引物克隆獲得其序列,其序列全長分別為1356 bp和846 bp,然后通過限制性內(nèi)切酶雙酶切后分別連接到表達(dá)載體pET-21a和pET-15b上,經(jīng)過質(zhì)粒PCR、雙酶切及測序鑒定,篩選出陽性表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)宿主菌成功構(gòu)建了表達(dá)GNMT基因和GalE基因的重組載體工程菌,然后將其在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá),用鎳親和層析、Mo
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