糞類圓線蟲RIOK-2蛋白激酶的表達(dá)純化、結(jié)晶條件初探和抗體制備.pdf

1、蛋白激酶，又叫蛋白磷酸化酶，是一類通過磷酸化底物行使功能的激酶，蛋白激酶在調(diào)節(jié)蛋白的活性和穩(wěn)定性，蛋白分子之間的互作以及亞細(xì)胞定位等方面發(fā)揮著重要作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可分為具有真核生物保守的激酶催化結(jié)構(gòu)域的真核生物蛋白激酶(Eukaryotic Protein Kinase，ePK)和被報(bào)道有激酶活性或者與ePK的結(jié)構(gòu)相似的非典型蛋白激酶(Atypical Protein Kinase，aPK)。RIO蛋白激酶家族是13類非典型蛋白激酶

2、中的一類，目前有報(bào)道的成員有RIOK-1，RIOK-2，RIOK-3和RIOK-B。RIO蛋白激酶家族成員具有很高的保守性，其中RIOK-1和RIOK-2更是廣泛地分布在從古細(xì)菌到人體內(nèi)，證明其二者在生物體內(nèi)具有非常重要的作用，已經(jīng)證實(shí)RIOK-1和RIOK-2在酵母和人體內(nèi)參與核糖體的合成和加工，還是保證細(xì)胞周期順利完成的重要因子，RIOK-2更是首例被報(bào)道的同時(shí)具有可能與核酸結(jié)合的wHTH結(jié)構(gòu)及激酶結(jié)構(gòu)域的分子，暗示RIOK-2可能

3、具有多重功能。鑒于RIO蛋白激酶，特別是RIOK-2發(fā)揮著如此重要的作用，有學(xué)者預(yù)測它可能作為良好的藥物靶標(biāo)可用于藥物開發(fā)。
　　蛋白質(zhì)晶體學(xué)是利用X射線衍射技術(shù)，研究蛋白質(zhì)分子及其復(fù)合物、組裝體三維結(jié)構(gòu)的統(tǒng)稱，是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要組成部分，解析蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，對于闡明蛋白質(zhì)分子發(fā)揮功能的機(jī)制以及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。目前，雖然原核生物熒光古菌和真核單細(xì)胞生物嗜熱毛殼菌RIOK-2的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明，但遺憾的是，真核多細(xì)胞生

4、物RIOK-2的晶體結(jié)構(gòu)尚未能夠得到解析，RIOK-2生理狀態(tài)下的底物仍然未知，為此，本課題進(jìn)行了以下幾方面的研究:
　　(1)糞類圓線蟲RIOK-2的生物信息學(xué)分析
　　在實(shí)驗(yàn)室已獲得Ss-riok-2編碼區(qū)cDNA的基礎(chǔ)上，將其氨基酸序列，與已經(jīng)解析出結(jié)構(gòu)的熒光古菌和嗜熱毛殼菌RIOK-2，以及研究較多的人類RIOK-2進(jìn)行了比對分析，發(fā)現(xiàn)RIOK-2保守程度很高，與熒光古菌RIOK-2，嗜熱毛殼菌RIOK-2和人類RI

5、OK-2的相似性分別達(dá)到15.8％，34.1％和42％，其中，包含了RIO結(jié)構(gòu)域的N端高度保守，差異比較顯著的區(qū)域集中在C端。
　　(2)糞類圓線蟲RIOK-2野生型、D228A突變型、截短型的原核表達(dá)純化
　　構(gòu)建原核表達(dá)載體，在體外成功進(jìn)行了原核表達(dá)并獲得高純度的蛋白(8～10mg/mL)。RIOK-2在純化過程中非常容易發(fā)生降解，但通過野生型和D228A突變型（實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)第228位天冬氨酸是Ss-RIOK-2的催化活

6、性位點(diǎn)）蛋白的純化對比發(fā)現(xiàn)，RIOK-2的降解與其催化活性有無無關(guān);截短表達(dá)的RIOK-2只保留了1～329位氨基酸（含wHTH結(jié)構(gòu)和RIO結(jié)構(gòu)域），在純化過程中證實(shí)截短型RIOK-2的降解情況有所改善，但是由于截去了親水性較高的C端氨基酸，因此蛋白在濃度達(dá)到約1 mg/mL以上時(shí)即發(fā)生沉淀。
　　(3)糞類圓線蟲RIOK-2野生型蛋白結(jié)晶條件的探索
　　利用商品化的晶體篩選試劑盒進(jìn)行了結(jié)晶初篩，經(jīng)過多次調(diào)整結(jié)晶條件之后，得

7、到了疑似晶體的片狀結(jié)構(gòu)。對該條件進(jìn)行重復(fù)，以及沉淀劑和鹽離子濃度的優(yōu)化，沒有得到與初篩時(shí)相同的結(jié)果，因此無法確定該片狀結(jié)構(gòu)是否是蛋白晶體。
　　(4)抗糞類圓線蟲RIOK-2多克隆抗體的制備
　　進(jìn)行日本長耳白兔免疫實(shí)驗(yàn)，制備了抗糞類圓線蟲RIOK-2多克隆抗體，用該多克隆抗體免疫印跡糞類圓線蟲總蛋白，結(jié)果表明制備的多克隆抗體能夠識別糞類圓線蟲內(nèi)源RIOK-2，Western blot結(jié)果條帶單一，特異性良好，能夠用于后續(xù)的