利用大腸桿菌表達(dá)和純化乙型肝炎病毒蛋白HBx.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)可引發(fā)慢性肝炎、肝硬化等疾病，是引發(fā)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinomas，HCC）的主要因素之一，嚴(yán)重危害人類健康。乙型肝炎病毒調(diào)節(jié)蛋白(Hepatitis B virus X protein，HBx)是HBV基因編碼的一種高度保守的蛋白，含有154個(gè)氨基酸。文獻(xiàn)報(bào)道，HBx的轉(zhuǎn)錄活性對(duì)HBV病毒復(fù)制功能起到非常重要的作用，是病毒DNA復(fù)制的中心調(diào)解器。此

2、外，HBx還參與基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)降解等過(guò)程，并在HCC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。HBx與DDB1(damage-specific DNA binding protein1)相互作用對(duì)病毒感染及病毒基因組復(fù)制、基因不穩(wěn)定性及細(xì)胞凋亡均有促進(jìn)作用。2010年，Li，T.等解析出全長(zhǎng)DDB1與HBxα螺旋結(jié)構(gòu)域（88-100aa）的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，該研究表明HBx通過(guò)它高度保守的α螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合DDB1，與宿主Cul

3、4-DDB1-Roc1泛素連接酶形成新的復(fù)合物。2016年，Decorsière,A.等發(fā)現(xiàn)HBx通過(guò)劫持宿主Cul4-DDB1-Roc1泛素連接酶促進(jìn)Smc5/6的蛋白質(zhì)降解，Smc5/6是一種對(duì)HBV基因復(fù)制有抑制作用的復(fù)合物。近些年的研究表明HBxα螺旋結(jié)構(gòu)域以外的區(qū)域同樣對(duì)HBV病毒復(fù)制的最大化起到重要作用，但由于缺乏HBx全長(zhǎng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，HBxα螺旋結(jié)構(gòu)域以外的區(qū)域是如何結(jié)合相互作用蛋白并且促進(jìn)HBV病毒復(fù)制的機(jī)制尚不清楚

4、。
　　目的：探討如何利用大腸桿菌系統(tǒng)獲得大量的可溶性的單體型的HBx重組蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)獲得優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)晶體，為今后解析HBx重組蛋白的三維結(jié)構(gòu)、研究HBx與其結(jié)合蛋白之間的相互作用機(jī)制和探討HBx生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。
　　方法：⑴篩選多個(gè)標(biāo)簽蛋白，尋找有助于提高目的蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)量的標(biāo)簽蛋白。⑵根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，構(gòu)建兩個(gè)較穩(wěn)定的HBx截短體1-127aa與43-154aa，并添加氨基端MBP標(biāo)簽獲得重組蛋

5、白表達(dá)質(zhì)粒。⑶通過(guò)Swissmodel軟件預(yù)測(cè)HBx形成多聚體的疏水界面，經(jīng)過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有利于獲得單體型的重組蛋白的突變型。⑷采用親和層析法、離子交換層析法、分子體積排阻色譜法等純化手段大規(guī)模表達(dá)純化最優(yōu)的表達(dá)質(zhì)粒。⑸將純化后所獲得的高濃度、高純度的HBx重組蛋白用于蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)結(jié)晶試劑盒篩選，初步篩選出重組蛋白的結(jié)晶條件。
　　結(jié)果：①與文獻(xiàn)中報(bào)道的類似，我們發(fā)現(xiàn)添加Gst或His標(biāo)簽蛋白并不能提高HBx重組蛋白的

6、可溶性表達(dá)量和改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，但是添加MBP標(biāo)簽蛋白可以明顯的提高重組蛋白的可溶性表達(dá)量。②經(jīng)過(guò)一系列嘗試，我們確定His-MBP-HBx43-154aa是最佳表達(dá)質(zhì)粒。由于野生型重組蛋白質(zhì)是多聚體，無(wú)法結(jié)晶。我們依據(jù)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，針對(duì)蛋白質(zhì)疏水界面上的若干個(gè)氨基酸依次進(jìn)行突變，最終，我們獲得最佳突變組合是F73D/F132D/V133D。利用這樣的組合，我們可以獲得最多的單體型重組蛋白（單體型比例占34.48％）。③經(jīng)過(guò)一系列蛋白

7、質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)，我們獲得了高濃度、高純度（10.27mg/ml，目的蛋白比例占72.10％）的HBx重組蛋白。通過(guò)結(jié)晶試劑盒篩選，我們初步獲得梭形蛋白質(zhì)晶體，結(jié)晶試劑包含pH8.5(0.1M Bis-tris propane)、SodiumCitrate(0.1M)和PEG3350(30％)。晶體生長(zhǎng)溫度為20℃，生長(zhǎng)周期約14天。
　　結(jié)論：⑴通過(guò)構(gòu)建多個(gè)HBx重組蛋白質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)His-MBP-HBx43-154aa可溶性蛋白表達(dá)量