半夏蛋白的純化結(jié)晶、表達(dá)及microRNA研究.pdf

1、半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)是單子葉天南星科半夏屬植物,以塊莖入藥,具有燥濕化痰,降逆止嘔,消痞散結(jié)的功效及抗早孕、抗?jié)?、抗心律失常、降血脂、?zhèn)靜催眠、解毒抗炎以及抗癌等藥理作用,是我國(guó)重要的常用中藥,其主要成分有多糖、生物堿、甾醇以及凝集素等。近年來(lái),植物凝集素的研究得到飛速的發(fā)展,尤其是甘露糖特異性的天南星科植物凝集素被發(fā)現(xiàn)可在哺乳動(dòng)物的很多重要的生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,半夏蛋白(Pine

2、llia ternataagglutinin,PTA)作為一個(gè)很有潛力的抗腫瘤甘露糖結(jié)合凝集素也逐漸受到人們的關(guān)注,但是目前其結(jié)構(gòu)仍未得到解析,若能夠?qū)Π胂牡鞍椎慕Y(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,對(duì)半夏蛋白的深入研究具有較大的意義。
　　 此外,半夏屬植物還具有一些較為獨(dú)特的生物學(xué)特征,比如半夏可通過(guò)塊莖、種子等繁殖之外,還可以在葉莖、葉底和塊莖上長(zhǎng)出珠芽進(jìn)行繁殖,這種現(xiàn)象即使在天南星科植物中也是少見(jiàn)的;而掌葉半夏(Pinellia pedatis

3、ecta Schott.)在半夏屬中也比較獨(dú)特,它是本屬唯一葉片呈掌狀,塊莖最大的植物。植物miRNA作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子在植物生理過(guò)程的各個(gè)方面均扮演著重要的作用。然而,目前仍未見(jiàn)半夏屬植物miRNA的相關(guān)報(bào)道,若對(duì)半夏以及掌葉半夏miRNA進(jìn)行研究,將為植物miRNA在這兩種植物的生命活動(dòng)及半夏蛋白的表達(dá)的調(diào)節(jié)等的研究提供一定參考。
　　 在本研究中,我們通過(guò)硫酸銨沉淀、親和層析色譜、分子篩凝膠層析色譜、離子交換層析色譜

4、、疏水層析色譜等方法從半夏塊莖中分離純化適合于蛋白質(zhì)結(jié)晶的半夏蛋白樣品。首先根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)利用75％的硫酸銨從半夏塊莖的勻漿收集液中鹽析出蛋白質(zhì)成分,然后利用Mannose-Sepharose4B親和層析色譜技術(shù)從硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)成分中截留富集甘露糖特異性結(jié)合的半夏蛋白成分,此步回收的蛋白質(zhì)樣品純度較高,僅含有少量的雜質(zhì),接著使用SuperdexTM75分子篩層析色譜技術(shù)從蛋白質(zhì)分子量以及分子形狀上進(jìn)一步純化半夏蛋白樣品,經(jīng)SDS

5、-PAGE蛋白電泳發(fā)現(xiàn)回收的蛋白質(zhì)樣品達(dá)到電泳純,該純度已達(dá)到蛋白質(zhì)結(jié)晶的要求,但在使用Mono QTM離子交換層析色譜分析該蛋白質(zhì)的電荷均一性的時(shí)候發(fā)現(xiàn)雜峰很多,因此我們收集峰值最大的色譜峰,并利用HiTrapTM Phenyl HP疏水層析色譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的純化,利用SDS-PAGE以及Native-PAGE電泳技術(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)樣品在分子量大小、分子形狀、電荷以及表面疏水性等方面均達(dá)到均一性。并且利用MS證實(shí)該蛋白質(zhì)

6、為PTA。利用倍比稀釋法對(duì)純化的半夏蛋白進(jìn)行凝血活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠的血紅細(xì)胞具有顯著的凝集作用,最小凝集濃度為0.012mg/mL。本研究還利用懸滴蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶法對(duì)該蛋白進(jìn)行結(jié)晶,通過(guò)初始結(jié)晶條件的篩選、結(jié)晶條件的優(yōu)化,最后成功的在存在配基和不存在配基的情況下獲得了半夏蛋白的晶體。在本研究中我們還通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-pta以及重組家蠶桿狀病毒Bacmid/BmNPV/pta成功的在大腸桿菌、家蠶細(xì)胞及家蠶蛹中表達(dá)了半夏蛋

7、白,并初步對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的半夏蛋白包涵體嘗試了透析復(fù)性以及柱上復(fù)性,復(fù)性產(chǎn)物的溶解度有所增加但是均一性不佳,仍需要進(jìn)一步的優(yōu)化以達(dá)到適合結(jié)晶的標(biāo)準(zhǔn);同時(shí),還對(duì)家蠶蛹表達(dá)的可溶性半夏蛋白進(jìn)行了純化,在分子大小和形狀上均一性較好,但是回收量太低,在今后的研究中還需對(duì)其表達(dá)量以及純化工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。
　　 同時(shí),本研究還通過(guò)利用微流體miRNA芯片、RT-PCR以及Real-time PCR對(duì)半夏以及掌葉半夏miRNA進(jìn)行了初步