麻竹轉(zhuǎn)錄因子DlSCL6和DlAP2功能研究及葉片miRNA的分離鑒定.pdf

1、麻竹（Dendrocalamus latiflorus）是我國(guó)南方廣泛栽培的重要竹種之一，具有食用、材用、綠化等多種用途，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。植物基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄以及翻譯水平等多個(gè)層的精準(zhǔn)調(diào)控，研究竹子基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理對(duì)于深入了解竹子的生命現(xiàn)象，更好地開發(fā)利用竹子資源具有重要價(jià)值。轉(zhuǎn)錄因子參與基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，miRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，二者都是植物基因表達(dá)調(diào)控的重要方式。本研究以麻竹為對(duì)象，針對(duì)SCL6和AP2這兩個(gè)植物特有的轉(zhuǎn)

2、錄因子進(jìn)行了研究，同時(shí)開展了麻竹葉片miRNA的分析研究，并對(duì)其部分新miRNA的表達(dá)進(jìn)行了分析探討。主要研究成果如下:
　　 (1)利用RT-PCR和RACE方法，從麻竹葉片中克隆到與其生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因DlSCL6和DlAP2。DlSCL6基因cDNA全長(zhǎng)2006 bp，5'非編碼區(qū)(UTR)124 bp，3'UTR266 bp，含有一個(gè)1611 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼536個(gè)氨基酸;DlAP2基因cD

3、NA全長(zhǎng)1731 bp，其中5'UTR81 bp，3'UTR186 bp，ORF1464 bp，共編碼487個(gè)氨基酸。
　　 (2)分別構(gòu)建了DlSCL6基因的正義和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana），并對(duì)抗性植物進(jìn)行RT-PCR鑒定，分別獲得了DlSCL6基因的正義、反義轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型觀察顯示，轉(zhuǎn)正義DlSCL6基因植株?duì)I養(yǎng)期延長(zhǎng)，開花延遲，植株粗壯高大，

4、蓮座葉數(shù)量增加;而轉(zhuǎn)入反義基因的植株開花提前，植株瘦弱，且蓮座葉數(shù)量明顯減少。轉(zhuǎn)反義DlSCL6基因植株表型與矮牽牛（Petuniahybrida）、擬南芥中ham基因功能缺失的表型類似，這意味著DlSCL6基因與擬南芥等植物中HAM亞家族基因具有類似功能，可能在竹子維持頂端分生組織分生活性中發(fā)揮重要作用。
　　 (3)將DlAP2基因構(gòu)建到pCAMBIA1300載體的多克隆位點(diǎn)，形成DlAP2基因的過量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)

5、法成功獲得了轉(zhuǎn)DlAP2基因的擬南芥植株，并利用RT-PCR方法證明DlAP2基因在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定表達(dá)。與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)DlAP2基因植株開花提前，表明DlAP2可能具有促進(jìn)麻竹開花的功能。
　　 (4)構(gòu)建了麻竹葉片miRNA文庫(kù)，利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)序得到11513607條序列，去除低質(zhì)量序列、5'端污染、3'端接頭缺失、插入片段缺失、polyA片段以及小于18 nt的序列后，得到干凈序列(clean r

6、eads)10593305條。應(yīng)用生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測(cè)得到165種候選的miRNA，其中與已知的其他物種miRNA同源性較高的保守miRNA有84種（其中miRNA54種，miRNA*30種），分別屬于17個(gè)已知的miRNA家族;非保守的新miRNA共81種（其中miRNA76種，miRNA*5種）。搜索比對(duì)麻竹EST數(shù)據(jù)庫(kù)和毛竹CDS數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)麻竹新miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到靶基因176個(gè)，其中37個(gè)來自麻竹EST數(shù)據(jù)庫(kù)，13

7、9個(gè)來自毛竹基因組CDS數(shù)據(jù)。
　　 (5)根據(jù)獲得麻竹葉片新miRNA序列特征，設(shè)計(jì)高度特異的反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物，對(duì)表達(dá)量較高的30種新miRNA進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，所檢測(cè)miRNA的溶解曲線均高度特異，表明其在麻竹葉片中是真實(shí)存在的，并非背景信號(hào)。采用qRT-PCR方法對(duì)這30種新miRNA在不同光照環(huán)境下的表達(dá)差異分析表明:在強(qiáng)光脅迫下(1200μmol/m2/s1)，dla-miRC18、dla-miRC27

8、、dla-miRC27-3p的表達(dá)明顯上調(diào)，其中dla-miRC27-5p的上調(diào)幅度最大（達(dá)到對(duì)照的15倍），而dla-miRC1、dla-miRC19和dla-miRC28的表達(dá)明顯下調(diào)（62％-76％）;黑暗條件下，這些miRNA的表達(dá)變化相對(duì)較小，僅有dla-miRC1和dla-miR22的上調(diào)幅度比較明顯（是對(duì)照的4倍左右），dla-miRC5、dla-miRC17和dla-miRC29的下調(diào)幅度達(dá)到50％-72％。由此表明，在