豬胞內(nèi)勞森氏菌抗原候選蛋白的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、本研究以胞內(nèi)勞森氏菌陽(yáng)性豬回腸粘膜DNA為模板，通過(guò)PCR和Nested-PCR的方法擴(kuò)增出胞內(nèi)勞森氏菌四個(gè)抗原候選蛋白（即外膜蛋白OMP1022、外膜蛋白OMP0902、外膜蛋白OMP1024和表面脂蛋白SLP0235）的基因序列，并分別構(gòu)建T-A克隆質(zhì)粒，再亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中得到原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-OMP1022、pET32a-OMP0902、pET32a-OMP1024和pET32a-SLP0235，

2、酶切鑒定及序列測(cè)定表明，重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　 將原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-OMP1022、pET32a-OMP0902、pET32a-OMP1024和pET32a-SLP0235轉(zhuǎn)入宿主表達(dá)菌BL-21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白1022和0902獲得表達(dá)，而重組蛋白1024和0235未表達(dá)或表達(dá)量過(guò)低。分兩段擴(kuò)增OMP1024，得到1024a和1024b，并構(gòu)建得到原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-OMP1024a

3、和pET32a-OMP1024b，轉(zhuǎn)入宿主表達(dá)菌BL-21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均得到表達(dá)。Western-blot證實(shí)重組蛋白1022、0902、1024a和1024b均有較好的抗原性。重組蛋白1022為可溶性表達(dá)，其余以包涵體的形式得到表達(dá)。Ni2+親和層析法進(jìn)行純化獲得純化蛋白。Western-blot驗(yàn)證純化復(fù)性后重組蛋白的抗原性，結(jié)果顯示均具有良好的抗原性，其中重組蛋白1024b的抗原性最強(qiáng)。
　　 以純化后的

4、重組蛋白1024b作為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)方法，優(yōu)化后確定最佳反應(yīng)條件為:抗原包被濃度為0.5μg/mL，37℃包被2h;血清稀釋40倍，37℃反應(yīng)1h;二抗稀釋8000倍，37℃反應(yīng)30min;TMB底物室溫顯色10min。用優(yōu)化好的ELISA反應(yīng)條件檢測(cè)20份陰性血清，確定陰陽(yáng)性臨界值為0.321。血清吸附試驗(yàn)、交叉反應(yīng)試驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)證明LI-1024b間接ELISA具有很好的特異性。
　　 利用建立好的LI