豬藍(lán)耳病病毒NSP2基因主要抗原區(qū)域的原核表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬藍(lán)耳病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬成員。該病以母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎以及各種年齡豬的呼吸道疾病為特征，可通過胎盤、排泄物、空氣等多種途徑傳播。2006年該病以豬表現(xiàn)“無名高熱”的形式在我國大流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，建立一種快速高效的診斷方法對PRRSV的檢測及預(yù)防尤

2、為重要。
　　 本文從HP-PRRSV(JX0601)株細(xì)胞毒提取總RNA，根據(jù)GenBank上的參考序列設(shè)計了一對擴(kuò)增HP-PRRSV的NSP2基因主要抗原區(qū)的特異性引物，在引物的上下游引物分別帶有NcoⅠ、Sa1Ⅰ酶切位點(diǎn)。通過RT-PCR獲得長約485bp的目的片段，將其克隆到pGEM-TEasy載體，獲得重組質(zhì)粒pGEM-dNSP2。
　　 用相同的限制性內(nèi)切酶酶切陽性質(zhì)粒pGEM-dNSP2和表達(dá)載體pET-3

3、2a后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-dNSP2，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)酶切及PCR鑒定篩選出陽性克隆，測序證明目的基因以正確的閱讀框插入了表達(dá)載體。用IPTG誘導(dǎo)重組載體的表達(dá)，收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，原核表達(dá)產(chǎn)物大小約為38.3KDa。進(jìn)一步優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度、培養(yǎng)時間和溫度等條件，最后確定以37℃培養(yǎng)至(0)D600達(dá)0.6左右，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，再以37℃繼續(xù)培養(yǎng)5h，這樣的培養(yǎng)條件下表達(dá)量最大

4、，經(jīng)分析表達(dá)蛋白量約占菌體蛋白的40.3％。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot分析，能被PRRSV陽性血清所識別。試驗(yàn)結(jié)果表明高致病性PRRSV(JX0601) NSP2蛋白主要抗原區(qū)在大腸桿菌中高效表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性。
　　 目的蛋白經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，證明重組蛋白以可溶性形式存在于超生裂解液上清中，用鎳柱親和層析法從上清中純化目的蛋白。以純化后的目的蛋白作為抗原包被聚乙烯微量反應(yīng)板，初步

5、建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法。試驗(yàn)表明:抗原的最適包被濃度為20μg/mL，血清最適稀釋度為1∶160;最適封閉液為1％BSA，封閉時間為37℃1h，最佳血清及二抗反應(yīng)條件及時間均為37℃1h; HRP-兔抗豬IgG的最適工作濃度為1∶5000;底物顯色液的最佳反應(yīng)時間為15min;統(tǒng)計學(xué)分析后確定陰陽性的臨界值為0.35。通過特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、符合性試驗(yàn)及對臨床樣品檢測的結(jié)果顯示，該方法特異、敏感、快速和操作簡便