十字花科黑腐病菌中表達(dá)受ZnSO4和EDTA影響的小RNA的鑒定和功能研究.pdf

1、細(xì)菌小RNA是長(zhǎng)度為50-500 nt，一般不含有開放閱讀框(ORF)，因此不編碼蛋白，但是卻有獨(dú)立的功能的RNA分子。小RNA廣泛存在于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌中;它們?cè)诩?xì)菌的碳代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、群體感應(yīng)、致病以及對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答等許多不同的生理過程發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。眾所周知，細(xì)菌對(duì)環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，而最近的研究發(fā)現(xiàn)，小RNA在細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)中發(fā)揮了非常重要的作用。在眾多的環(huán)境脅迫中，重金屬脅迫（重金屬離子過量或缺

2、乏）是細(xì)菌在自然生存條件下經(jīng)常遇到的環(huán)境脅迫之一。已有證據(jù)證明，小RNA在調(diào)控細(xì)菌的鐵離子代謝中起關(guān)鍵作用。但是，小RNA在包括鋅離子在內(nèi)的其它重金屬代謝中的作用還不十分清楚。
　　 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)是引起甘藍(lán)、蘿卜、白菜、油菜等十字花科農(nóng)作物黑腐病的病原菌，同時(shí)也是研究病原細(xì)菌致病分子機(jī)理的模式菌之一。為了鑒定Xcc中參與對(duì)高鋅離子濃度的耐受以

3、及對(duì)缺鋅條件的適應(yīng)的小RNA，本研究首先采用RNA測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)，鑒定了Xcc中表達(dá)受添加ZnSO4和EDTA影響的小RNA，然后對(duì)部分表達(dá)受添加ZnSO4和EDTA影響的小RNA的生物學(xué)功能進(jìn)行了鑒定。
　　 為了在全基因組水平上鑒定Xcc中表達(dá)受ZnSO4和EDTA影響的小RNA，本研究分別在豐富培養(yǎng)基NYG以及在添加了EDTA（終濃度為300μM）或ZnSO4（終濃度為350μM）的NYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)Xcc80

4、04菌株至對(duì)數(shù)期，然后收集細(xì)胞提取總RNA。去除rRNA后，用變性PAGE膠對(duì)總RNA進(jìn)行電泳分離，然后分別回收總RNA中大小為50-200 nt和201-500 nt的小分子RNA，最后進(jìn)行Solexa cDNA庫構(gòu)建和測(cè)序。接著，用本實(shí)驗(yàn)室之前建立的方法對(duì)Solexa測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出表達(dá)受ZnSO4和EDTA影響的候選小RNA。最后，用Northem雜交或RT-PCR對(duì)這些選小RNA進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 Solexa測(cè)序數(shù)

5、據(jù)分析結(jié)果顯示，以表達(dá)豐度差異大于或等于5倍為篩選條件，表達(dá)受ZnSO4影響的有222個(gè)（誘導(dǎo)81個(gè)，抑制145個(gè)），受EDTA影響的候選小RNA有540個(gè)（誘導(dǎo)334個(gè)，抑制206個(gè)），表達(dá)同時(shí)受EDTA和ZnSO4影響的有108個(gè)（同時(shí)受誘導(dǎo)47個(gè)，同時(shí)受抑制61個(gè)）。本研究隨機(jī)選了17個(gè)表達(dá)受EDTA或ZnSO4影響的候選小RNA進(jìn)行Northern雜交或半定量RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與Solexa測(cè)序數(shù)據(jù)基本一致，說明本研究的So

6、lexa測(cè)序在小RNA的定性和定量方面均是可靠的。
　　 為了確定候選小RNA的轉(zhuǎn)錄方向，本研究分別通過Northern雜交或鏈特異性RT-PCR對(duì)部分小RNA的轉(zhuǎn)錄方向進(jìn)行確定，目前，本研究已經(jīng)確定了11個(gè)小RNA的轉(zhuǎn)錄方向。
　　 為了弄清這些表達(dá)受EDTA和ZnSO4影響的小RNA是否在Xcc對(duì)重金屬脅迫的適應(yīng)中發(fā)揮作用，本研究分別通過缺失和過量表達(dá)兩種方法對(duì)這些小RNA的功能進(jìn)行研究。目前已經(jīng)完成了6個(gè)小RNA的

7、缺失突變體和過量表達(dá)株的構(gòu)建，并對(duì)這些缺失突變體和過量表達(dá)株對(duì)EDTA的耐受力以及對(duì)Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Cd2+和Cu2+等重金屬離子的耐受力進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，這6個(gè)表達(dá)受ZnSO4和EDTA影響的小RNA的缺失突變體和過量表達(dá)株對(duì)EDTA的耐受力以及對(duì)Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Cd2+和Cu2+等重金屬離子的耐受力和野生型菌株沒有顯著差異，說明這些小RNA在Xcc對(duì)重金屬脅迫的適應(yīng)中沒有或只發(fā)揮微

8、弱的作用。此外，本研究還對(duì)這6小RNA的缺失突變體和過量表達(dá)株的致病力、致病因子產(chǎn)生、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性等表型進(jìn)行了檢測(cè)和分析。結(jié)果顯示，它們?cè)谥虏×?、致病因子產(chǎn)生、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性等方面和野生型菌株沒有顯著差異。說明這些小RNA在這些表型相關(guān)的細(xì)胞過程中沒有作用或只發(fā)揮微弱的作用。
　　 綜上所述，本工作采用RNA測(cè)序方法，在Xcc8004中發(fā)現(xiàn)了幾百個(gè)表達(dá)受ZnSO4和EDTA影響的候選小RNA，其中17個(gè)通過了Northern雜交或半定