十字花科黑腐病菌中表達受酸堿影響的小RNA的鑒定和功能研究.pdf

1、細菌小、RNA(small RNA，sRNA)，又稱為非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)，是一類長度約為50-500 bp，通常不編碼蛋白質，但又具有獨立功能的RNA分子。研究表明，小RNA在細菌的群體感應、碳代謝、致病性、運動性以及應對環(huán)境脅迫等生理過程中發(fā)揮了關鍵的調控作用。酸、堿脅迫是細菌在自然生存狀態(tài)下遇到的環(huán)境脅迫的重要方面，細菌對酸堿脅迫的耐受和適應對它們在特定環(huán)境條件下的生存和繁殖具有非常重要的意義。盡

2、管人們對細菌對酸堿脅迫的耐受和適應的機理有了較廣泛深入的了解，但對小RNA在其中的作用還知之甚少。
　　 十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar campestris，Xcc）是引起包括許多重要農作物（如白菜、蘿卜、青菜、甘藍等重要蔬菜，以及油料作物油菜）黑腐病的病原菌，也是研究病原細菌與植物互作分子機制的模式菌之一。為了鑒定Xcc中參與酸堿脅迫的小RNA，本研究中，我們采用RNA測序(

3、RNA-seq)技術，在全基因組水平上鑒定了Xcc中表達分別受酸和堿影響的小RNA，并對部分表達受酸、堿影響的小RNA進行了功能鑒定。
　　 首先，通過測定Xcc在不同pH值的NYG豐富培養(yǎng)基中生長受影響的程度，確定用pH4.5和pH10.0的NYG培養(yǎng)基分別代表酸、堿脅迫環(huán)境，而pH7.0的NYG培養(yǎng)基作為Xcc生長的正常環(huán)境。接著，我們分別在這三種pH值的NYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)Xcc8004菌株至對數(shù)期，提取總RNA并去除rRN

4、A，然后分別回收50-200 nt和201-500nt大小的RNA進行Solexa cDNA庫構建和測序。最后，我們用本實驗室之前建立的方法對Solexa測序數(shù)據進行分析，篩選出表達受酸堿影響的候選小RNA。候選小RNA經Northern雜交或RT-PCR驗證后確定為表達受酸堿影響的小RNA。結果，我們發(fā)現(xiàn)了477個表達受酸影響，53個表達受堿影響的候選小RNA（其中27個表達既受酸也受堿的影響）。目前已有28個表達受酸堿影響的小RNA

5、（其中13個表達受酸影響、1個表達受堿影響和14個表達同時受酸和堿影響）通過了Northern雜交或RT-PCR驗證。
　　 為了證實這些表達受酸、堿影響的小RNA是否參與Xcc的酸堿脅迫過程，我們通過缺失和過量表達兩種方法對這些小RNA的功能進行研究。目前已經完成了5個小RNA(sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485、sR4019-4020和sR1332-1333)的缺失突變體和4個小RNA(s

6、R2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020)的過量表達株構建和表型分析。酸、堿脅迫耐受性檢測實驗結果顯示，盡管所有缺失突變體對酸和堿的耐受性和野生型菌株Xcc8004的耐受性沒有顯著差異，但是，小RNA sR2160-2161、sR2483-2484和sR4019-4020的過量表達株對酸和堿的耐受性比攜帶有空的過量表達載體野生型菌株(Xcc8004/pB)對酸和堿的耐受性顯著降低，說明

7、這三個小RNA在Xcc對酸和堿脅迫的耐受中起重要作用。小RNAsR2484-2485的過量表達株對酸的耐受性比Xcc8004/pB的耐受性顯著降低，但對堿的耐受性和Xcc8004/pB沒有顯著差異，說明這個小RNA在Xcc對酸脅迫的耐受中起重要作用，而在對堿脅迫的耐受中沒有或只起微弱作用。
　　 為了了解這幾個小RNA在Xcc對其它脅迫的適應中的作用，我們又檢測了它們的缺失突變體和過量表達株對重金屬離子(包括Ni2+、Cu2+、

8、Zn2+、Co2+、Mn2+、Cd2+)、SDS和NaCl的耐受性。結果說明sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020在Xcc對過量重金屬離子的耐受中起重要作用，而sR2483-2484和sR2484-2485在Xcc對SDS的耐受中起重要作用。
　　 此外，我們還檢測了這些小RNA缺失突變體和過量表達株的致病力、HR反應能力和致病因子的產生。檢測結果顯示，和Xcc8004/p

9、B相比，小RNA sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020的過量表達株的致病力減弱、HR反應延遲、胞外酶減少，但胞外多糖產量沒有顯著變化。小RNA sR2160-2161、sR2484-2485和sR4019-4020的缺失突變體的致病力比野生型菌株Xcc8004顯著下降。這些結果說明，小RNA sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4