十字花科黑腐病菌中表達(dá)受酸堿影響的小RNA的鑒定和功能研究.pdf

1、細(xì)菌小、RNA(small RNA，sRNA)，又稱為非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)，是一類長度約為50-500 bp，通常不編碼蛋白質(zhì)，但又具有獨(dú)立功能的RNA分子。研究表明，小RNA在細(xì)菌的群體感應(yīng)、碳代謝、致病性、運(yùn)動(dòng)性以及應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫等生理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。酸、堿脅迫是細(xì)菌在自然生存狀態(tài)下遇到的環(huán)境脅迫的重要方面，細(xì)菌對(duì)酸堿脅迫的耐受和適應(yīng)對(duì)它們?cè)谔囟ōh(huán)境條件下的生存和繁殖具有非常重要的意義。盡

2、管人們對(duì)細(xì)菌對(duì)酸堿脅迫的耐受和適應(yīng)的機(jī)理有了較廣泛深入的了解，但對(duì)小RNA在其中的作用還知之甚少。
　　 十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar campestris，Xcc）是引起包括許多重要農(nóng)作物（如白菜、蘿卜、青菜、甘藍(lán)等重要蔬菜，以及油料作物油菜）黑腐病的病原菌，也是研究病原細(xì)菌與植物互作分子機(jī)制的模式菌之一。為了鑒定Xcc中參與酸堿脅迫的小RNA，本研究中，我們采用RNA測序(

3、RNA-seq)技術(shù)，在全基因組水平上鑒定了Xcc中表達(dá)分別受酸和堿影響的小RNA，并對(duì)部分表達(dá)受酸、堿影響的小RNA進(jìn)行了功能鑒定。
　　 首先，通過測定Xcc在不同pH值的NYG豐富培養(yǎng)基中生長受影響的程度，確定用pH4.5和pH10.0的NYG培養(yǎng)基分別代表酸、堿脅迫環(huán)境，而pH7.0的NYG培養(yǎng)基作為Xcc生長的正常環(huán)境。接著，我們分別在這三種pH值的NYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)Xcc8004菌株至對(duì)數(shù)期，提取總RNA并去除rRN

4、A，然后分別回收50-200 nt和201-500nt大小的RNA進(jìn)行Solexa cDNA庫構(gòu)建和測序。最后，我們用本實(shí)驗(yàn)室之前建立的方法對(duì)Solexa測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出表達(dá)受酸堿影響的候選小RNA。候選小RNA經(jīng)Northern雜交或RT-PCR驗(yàn)證后確定為表達(dá)受酸堿影響的小RNA。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了477個(gè)表達(dá)受酸影響，53個(gè)表達(dá)受堿影響的候選小RNA（其中27個(gè)表達(dá)既受酸也受堿的影響）。目前已有28個(gè)表達(dá)受酸堿影響的小RNA

5、（其中13個(gè)表達(dá)受酸影響、1個(gè)表達(dá)受堿影響和14個(gè)表達(dá)同時(shí)受酸和堿影響）通過了Northern雜交或RT-PCR驗(yàn)證。
　　 為了證實(shí)這些表達(dá)受酸、堿影響的小RNA是否參與Xcc的酸堿脅迫過程，我們通過缺失和過量表達(dá)兩種方法對(duì)這些小RNA的功能進(jìn)行研究。目前已經(jīng)完成了5個(gè)小RNA(sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485、sR4019-4020和sR1332-1333)的缺失突變體和4個(gè)小RNA(s

6、R2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020)的過量表達(dá)株構(gòu)建和表型分析。酸、堿脅迫耐受性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管所有缺失突變體對(duì)酸和堿的耐受性和野生型菌株Xcc8004的耐受性沒有顯著差異，但是，小RNA sR2160-2161、sR2483-2484和sR4019-4020的過量表達(dá)株對(duì)酸和堿的耐受性比攜帶有空的過量表達(dá)載體野生型菌株(Xcc8004/pB)對(duì)酸和堿的耐受性顯著降低，說明

7、這三個(gè)小RNA在Xcc對(duì)酸和堿脅迫的耐受中起重要作用。小RNAsR2484-2485的過量表達(dá)株對(duì)酸的耐受性比Xcc8004/pB的耐受性顯著降低，但對(duì)堿的耐受性和Xcc8004/pB沒有顯著差異，說明這個(gè)小RNA在Xcc對(duì)酸脅迫的耐受中起重要作用，而在對(duì)堿脅迫的耐受中沒有或只起微弱作用。
　　 為了了解這幾個(gè)小RNA在Xcc對(duì)其它脅迫的適應(yīng)中的作用，我們又檢測了它們的缺失突變體和過量表達(dá)株對(duì)重金屬離子(包括Ni2+、Cu2+、

8、Zn2+、Co2+、Mn2+、Cd2+)、SDS和NaCl的耐受性。結(jié)果說明sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020在Xcc對(duì)過量重金屬離子的耐受中起重要作用，而sR2483-2484和sR2484-2485在Xcc對(duì)SDS的耐受中起重要作用。
　　 此外，我們還檢測了這些小RNA缺失突變體和過量表達(dá)株的致病力、HR反應(yīng)能力和致病因子的產(chǎn)生。檢測結(jié)果顯示，和Xcc8004/p

9、B相比，小RNA sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4020的過量表達(dá)株的致病力減弱、HR反應(yīng)延遲、胞外酶減少，但胞外多糖產(chǎn)量沒有顯著變化。小RNA sR2160-2161、sR2484-2485和sR4019-4020的缺失突變體的致病力比野生型菌株Xcc8004顯著下降。這些結(jié)果說明，小RNA sR2160-2161、sR2483-2484、sR2484-2485和sR4019-4