福建馬鈴薯病毒病的快速檢測技術(shù).pdf

1、馬鈴薯所具有的經(jīng)濟(jì)價值位列世界主要作物第四位，在我國馬鈴薯的總產(chǎn)量以及種植面積均居世界首位。馬鈴薯病毒病是馬鈴薯生產(chǎn)中制約馬鈴薯高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的關(guān)鍵性因素，通過脫毒技術(shù)生產(chǎn)健康種薯或近乎無毒的種薯，已經(jīng)成為預(yù)防馬鈴薯病毒病最為成功的手段之一。因此，建立一套快速，高效，穩(wěn)定的馬鈴薯檢測技術(shù)有利于加速育種進(jìn)程，保證種薯質(zhì)量和調(diào)運(yùn)的安全。本研究的主要目的是研究并建立適合于同時檢測四種馬鈴薯病毒的單重、多重RT-PCR分子檢測體系，并針對反應(yīng)體系中

2、的引物濃度比例、退火溫度、Mg2+濃度比例等影響因素進(jìn)行優(yōu)化，以期為研制馬鈴薯病毒病檢測試劑盒的開發(fā)提供技術(shù)保障。
　　1、RT-PCR特異性引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)已發(fā)表馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯S病毒(PVS)及馬鈴薯M病毒(PVM)四種病毒的外殼蛋白（CP）序列設(shè)計(jì)特異性引物對，擴(kuò)增片段大小為379bp（PVY）、514bp（PYA）、656bp（PVS）及881bp（PVM）。
　　2、PCR檢測

3、體系優(yōu)化：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，適當(dāng)提高退火溫度，有利于四重PCR擴(kuò)增；Mg2+濃度對單重PCR擴(kuò)增影響不大，但對四重PCR的擴(kuò)增有著明顯的影響；dNTPs濃度和引物濃度比對PCR擴(kuò)增效果影響不大。
　　3、擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性驗(yàn)證：經(jīng)NCBIBLAST比對，結(jié)果表明PVY、PVA、PVS和PVM四種病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與NCBIBLAST報道的相應(yīng)病毒的序列同源性分別達(dá)到99%、98%、98%和98%以上，表明四種病毒的RT-PCR擴(kuò)

4、增產(chǎn)物準(zhǔn)確無誤。
　　4、PCR靈敏度測定：通過對四種病毒cDNA的濃度稀釋，對4種病毒在單重PCR檢測中的最低檢測濃度進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，在PVY、PVA、PVS和PVM的單重PCR檢測中各病毒的最低檢測濃度分別為：0.299ng/?L，2.67ng/?L，0.296ng/?L和0.202ng/?L。
　　5、研究體系的應(yīng)用：采用四重RT-PCR檢測體系，對來自周寧、福州、龍巖及龍海地區(qū)共88個馬鈴薯種薯樣品檢測，結(jié)果表明