馬鈴薯病毒快速檢測(cè)體系的建立及馬鈴薯BRP1基因dsRNA的體外表達(dá).pdf

1、馬鈴薯病毒是造成馬鈴薯種質(zhì)退化的主要原因，可造成馬鈴薯產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降。侵染馬鈴薯的植物病毒有40多種，其中PVY、PVS、PVM、PLRV等在田間生產(chǎn)中普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響了馬鈴薯生產(chǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外主要通過(guò)生產(chǎn)馬鈴薯脫毒種薯來(lái)解決種質(zhì)退化問(wèn)題，這使馬鈴薯脫毒材料及種薯的病毒檢測(cè)顯得尤為重要，由此建立一套快速、有效的病毒檢測(cè)方法迫在眉睫；PSTVd很難通過(guò)莖尖脫毒去除，通過(guò)PSTVd結(jié)合蛋白探究其在寄主體內(nèi)的復(fù)制侵染是防控PSTVd的一

2、個(gè)新思路。基于此，本研究開(kāi)展了馬鈴薯主要病毒檢測(cè)方法和PSTVd結(jié)合蛋白相關(guān)基因的dsRNA研究，主要取得結(jié)果如下：
　　1.克隆了青島地區(qū)ToCV和PVM的CP基因，其核苷酸序列全長(zhǎng)分別為774bp、915bp。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，ToCV青島分離物與各分離物間CP基因序列的相似性為97.2％-99.6%，推導(dǎo)的氨基酸序列的相似性為97.3%-100%；PVM青島分離物與各分離物間CP基因序列的相似性為79.0%-95.5%

3、，推導(dǎo)的氨基酸序列相似性為84.5%-97.7%。
　　2.以感染PSTVd的植株總RNA作為模板，比較了一步RT-PCR方法與兩步RT-PCR方法，表明一步RT-PCR檢測(cè)技術(shù)具有快捷、簡(jiǎn)便、減少污染等優(yōu)點(diǎn)。以此為基礎(chǔ)，建立了馬鈴薯5種主要病毒（PVS、PLRV、PVY、PVM和ToCV）和1種類病毒（PSTVd）同時(shí)檢測(cè)鑒定的一步六重RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增得到目的條帶大小分別為932bp、781bp、628bp、534bp、2

4、29bp和359bp。
　　3.克隆了PSTVd的馬鈴薯結(jié)合蛋白BRP1蛋白基因，ORF全長(zhǎng)1809bp，含有191bp內(nèi)含子，推導(dǎo)的氨基酸序列全長(zhǎng)為602aa。其與番茄同源蛋白Virp1的氨基酸序列相似性在98%以上，其中核定位信號(hào)區(qū)域?yàn)?00%、bromodomain結(jié)構(gòu)域?yàn)?7%、RNA結(jié)合區(qū)域?yàn)?3%；構(gòu)建了針對(duì)BRP1蛋白基因的1217bp BRP11的dsRNA原核表達(dá)載體和548bp BRP12的dsRNA體外轉(zhuǎn)錄體