馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒的實(shí)時(shí)熒光同步檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、馬鈴薯是世界性高產(chǎn)作物，我國(guó)種植面積和產(chǎn)量都居世界第一位。馬鈴薯病毒病是馬鈴薯生產(chǎn)中的重要制約因素，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量，目前還沒(méi)有“特效藥”進(jìn)行防治。實(shí)際生產(chǎn)中，脫毒種薯是防治馬鈴薯的主要措施，而這需要快捷、簡(jiǎn)便。特異靈敏的檢測(cè)技術(shù)作為支撐。自PCR技術(shù)發(fā)明以來(lái)，RT-PCR已經(jīng)成為病毒檢測(cè)的一種普遍采用方法，該技術(shù)快速、特異、靈敏的特點(diǎn)，可以滿足國(guó)內(nèi)外現(xiàn)代植物檢疫的要求。由于馬鈴薯病毒病常常為多種病毒復(fù)合感染，其中馬鈴薯Y病毒(PV

2、Y)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)是危害最嚴(yán)重的病毒，并容易發(fā)生交叉感病。生產(chǎn)實(shí)踐迫切需要有能夠同時(shí)檢測(cè)兩種病毒的快速、靈敏檢測(cè)技術(shù)。
　　 為此，本研究在設(shè)計(jì)、篩選對(duì)馬鈴薯Y病毒(PVY)和馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)核酸特異性擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，通過(guò)比較篩選快捷制樣技術(shù)、優(yōu)化檢測(cè)程序和檢測(cè)條件，建立二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)體系，用于PVY、PLRV的同步檢測(cè)。該方法適用于馬鈴薯脫毒種薯質(zhì)量檢測(cè)和田間植株病害鑒定以及發(fā)病情況監(jiān)控，具

3、有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　 研究的主要內(nèi)容及結(jié)果：
　　 ⑴通過(guò)比較改進(jìn)CTAB法、試劑盒法、浸泡法、微濾柱離心法對(duì)提取RNA濃度和純度的影響，確定微濾柱離心法作為病害檢測(cè)的制樣方法，該方法能有效地排除植物色素、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)對(duì)RT-PCR反應(yīng)的干擾，制備適合于RT-PCR的馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒的RNA，減少RT-PCR的假陰性發(fā)生率。以RT-PCR獲得的DNA片段經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后以其為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得大量、高

4、質(zhì)量RNA作為無(wú)害化陽(yáng)性對(duì)照。
　　 ⑵選擇兩種病毒保守核苷酸序列區(qū)域分別設(shè)計(jì)各自的Taqman探針及其引物。標(biāo)記多種發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，分別建立了馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒的單重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法，對(duì)影響PCR反應(yīng)的一系列因素進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠在病毒檢測(cè)中進(jìn)行絕對(duì)定量，最低能檢測(cè)1500個(gè)拷貝模板數(shù)，在實(shí)際檢測(cè)運(yùn)用中取得很好的效果。
　　 ⑶在分別建立兩種病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，

5、經(jīng)過(guò)引物、探針以及檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立了馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒雙重RT-PCR檢測(cè)體系。經(jīng)確診樣品檢驗(yàn)及田間實(shí)際樣品檢測(cè)驗(yàn)證，該體系檢測(cè)特異性強(qiáng)，僅對(duì)PVY喝PLRV能檢出，其他馬鈴薯病毒病及病原菌不能檢出；靈敏度高，對(duì)PVY喝PLRV的檢測(cè)敏感性均達(dá)到1500個(gè)模板拷貝數(shù)，比常規(guī)RT-PCR敏感性高100倍；抗干擾能力強(qiáng)，不受樣品中兩種病毒含量差異的影響，并且能夠在病毒檢測(cè)中進(jìn)行相對(duì)定量，在實(shí)際檢測(cè)運(yùn)用中取得很好的效果。