新西蘭白兔骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的克隆及時(shí)空差異性表達(dá).pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族中最大和增速最快的成員，近年來(lái)，隨著研究成果的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其不光在誘導(dǎo)軟骨及骨組織定向分化中作用強(qiáng)大，在中胚層誘導(dǎo)、肢體發(fā)育、牙齒發(fā)育、造血細(xì)胞形成及動(dòng)物繁殖性狀表達(dá)等方面也起著重要作用。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上，對(duì)BMPs進(jìn)行克隆測(cè)序及電子克隆分析，研究了新西蘭白兔在不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中的時(shí)空差異性表達(dá)，以期確定BMPs在不同發(fā)育階段中所起的作用，從基因角度闡明新西蘭白兔的組織表

2、達(dá)譜規(guī)律。根據(jù)NCBI中GenBank已經(jīng)公布的人、豬、牛、綿羊、小鼠和大鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)的序列，利用計(jì)算機(jī)軟件DNAMAN進(jìn)行基因序列的同源性比對(duì)，找出BMP-2基因和BMP-4基因cDNA的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆這兩種基因，利用克隆的序列作為探針繼續(xù)進(jìn)行電子克隆，用生物信息學(xué)軟件對(duì)兩種基因的分子結(jié)構(gòu)和特征進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在mRN

3、A水平上檢測(cè)兩種基因在新西蘭白兔不同發(fā)育時(shí)期中卵巢、子宮、輸卵管、腎臟、肝臟、脾臟和十二指腸組織的表達(dá)情況。
　　通過(guò)上述方法得出如下試驗(yàn)結(jié)果:
　　1、根據(jù)保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR方法從新西蘭白兔卵巢、輸卵管、子宮中擴(kuò)增BMP-2和BMP-4基因部分cDNA序列，片段長(zhǎng)度分別為299bp和175bp。
　　2、分別以克隆測(cè)序出的BMP-2和BMP-4部分cDNA序列為探針，在nr數(shù)據(jù)庫(kù)及EST數(shù)據(jù)庫(kù)

4、中電子克隆兩個(gè)基因，克隆后的BMP-2基因?yàn)?150bp，BMP-4基因?yàn)?20bp。
　　3、應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析電子克隆BMP-2和BMP-4基因，其中BMP-2基因CDS區(qū)全長(zhǎng)1149bp，編碼383個(gè)氨基酸;BMP-4基因CDS區(qū)全長(zhǎng)918bp，編碼306個(gè)氨基酸。
　　4、利用生物信息學(xué)方法和相關(guān)軟件分析新西蘭白兔BMP-2和BMP-4基因的同源性，試驗(yàn)結(jié)果表明:新西蘭白兔BMP-2基因核苷酸序列與羊(XM004

5、014353)一致性為86％，與牛(BC134682)一致性為86％，與豬(EU854587)一致性為86％，與小鼠(BC100344)一致性為93％，與大鼠(L20678)一致性為93％，與人(AB463447)一致性為87％;新西蘭白兔BMP-4基因核苷酸序列與羊(AF508312)一致性為93％，與牛(NM001045877)一致性為94％，與豬(EU334835)一致性為94％，與小鼠(BC013459)一致性為91％，與大鼠(

6、NM012827)一致性為92％。
　　5、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到新西蘭白兔BMP-2基因在30日齡、60日齡和180日齡中卵巢組織中相對(duì)表達(dá)含量最高，在120日齡中肝臟組織中相對(duì)表達(dá)量最高;而B(niǎo)MP-4基因則在60日齡和180日齡中卵巢組織表達(dá)含量最高，30日齡中十二指腸表達(dá)含量最高，妊娠6天的母兔中肝臟表達(dá)含量最高。
　　6、兩基因同一組織在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律表現(xiàn)為:卵巢中BMP-2的mRNA變化幅度最

7、大，60日齡達(dá)到最高峰，輸卵管、子宮、脾臟均在120日齡時(shí)表達(dá)含量最高，30日齡時(shí)肝臟表達(dá)含量最高;卵巢中BMP-4的mRNA在60日齡時(shí)表達(dá)含量最高，輸卵管、子宮、腎臟、肝臟、脾臟則在妊娠6天母兔中表達(dá)含量最高，十二指腸在30日齡表達(dá)含量最高。
　　7、BMP-2基因和BMP-4基因在卵巢組織中都有較一致的表達(dá)趨勢(shì)，即60日齡最高，后下降，到180日齡又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在十二指腸中的表達(dá)也存在明顯的相似性，即隨著日齡的增大，兩基因