日本腦炎病毒樣顆粒疫苗及雙氧水滅活疫苗的探討性研究.pdf

1、豬乙型腦炎病原為日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)，屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬，該屬包括黃熱病(Yellowfevervirus)、日本乙腦病毒(JEV)、西尼羅河病毒(Westnilevirus)和登革熱病毒(Deguevirus)等多種嚴(yán)重危害人畜健康的病毒。目前預(yù)防豬乙型腦炎主要靠接種疫苗和防蚊滅蚊。
　　本研究初步探索了乙型腦炎顆粒疫苗以及新型乙腦病毒滅活劑的效

2、果，HBC是乙型肝炎核心抗原，其在多種表達(dá)體系中均被表達(dá)并能自組裝成病毒樣顆粒，是一種良好的表位展示免疫載體。另外據(jù)報(bào)道作為病毒滅活劑的雙氧水能快速有效滅活病毒，并且對(duì)病毒表面結(jié)構(gòu)的破壞相對(duì)傳統(tǒng)滅活劑-甲醛要小很多，本實(shí)驗(yàn)對(duì)以雙氧水為滅活劑的豬乙型腦炎滅活苗進(jìn)行初步研究。
　　1、展示JEVED(Ⅲ)loop3表位的病毒樣顆粒的制備及其免疫效果研究
　　JEVE蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ(EDⅢ)是誘導(dǎo)中和抗體的重要區(qū)域。據(jù)報(bào)道，體外實(shí)驗(yàn)

3、表明ED(Ⅲ)的一個(gè)環(huán)肽(loop3)能通過(guò)干擾病毒吸附細(xì)胞抑制病毒感染，接種該蛋白之后對(duì)小鼠的攻毒實(shí)驗(yàn)表明loop3是保護(hù)性最強(qiáng)的一段多肽。但loop3表位肽只是一段僅有9個(gè)氨基酸殘基的序列，該表位肽的免疫原性極低。乙肝核心蛋白(HepatitisBcoreprotein，HBC)是乙肝病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，它在細(xì)菌、真核細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)均能被高效表達(dá)并自動(dòng)裝配成病毒樣顆粒，而且在HBC特定位置插入的外源短肽序列不會(huì)影響HBC的構(gòu)

4、象及自我組裝，同時(shí)插入的外源短肽能以多次重復(fù)的方式被展現(xiàn)在病毒樣顆粒表面，從而能大大提高表位肽的免疫原性。因此將loop3基因與HBC基因重組，以該顆粒物質(zhì)為免疫載體，提高loop3表位的免疫原性。
　　根據(jù)以上所述，本文首先構(gòu)建了以HBC為載體的重組融合表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HBC-loop3，在HBC的MIR區(qū)插入JEVEDIIIloop3表位基因。SDS-PAGE證明，IPTG誘導(dǎo)后大腸桿菌高效上清表達(dá)了目的蛋白，表達(dá)量較高

5、，命名為HBC-loop3，純化過(guò)后，在透射電鏡下觀察，視野中具有大量病毒樣顆粒，證實(shí)了該該融合蛋白能自行組裝成病毒樣顆粒。
　　將純化的HBC-loop3輔以弗氏佐劑免疫5只5周齡清潔級(jí)小白鼠，接種部位為腹膜腔，接種蛋白量為50μg。然后利用本實(shí)驗(yàn)室建立的間接ELISA法以及血凝抑制法和空斑中和試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)免疫效果，結(jié)果為:蛋白免疫組抗體ELISA值(0.59)顯著大于PBS組值(0.18)，蛋白免疫組血清的血凝抑制效果也高于PB

6、S組，而空斑抑制試驗(yàn)顯示血清中未檢測(cè)到中和抗體。
　　2、以雙氧水為滅活劑的豬乙型腦炎病毒滅活苗試制與初步效果試驗(yàn)
　　本研究中使用的是免疫原性良好的豬源乙腦病毒-NANJING08株。本實(shí)驗(yàn)用過(guò)氧化氫和甲醛分別滅活JEV病毒，然后輔以弗氏佐劑免疫5只5周齡清潔級(jí)小白鼠，接種部位為腹膜腔，接種病毒劑量為1×106PFU，運(yùn)用間接ELISA法、血凝抑制法和空斑中和試驗(yàn)對(duì)免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。ELISA結(jié)果顯示雙氧水滅活組ELISA