海帶(Saccharina japonica)內(nèi)參基因篩選及部分管家基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析.pdf

1、熒光定量PCR（qPCR）是進(jìn)行基因表達(dá)量測定最準(zhǔn)確易行的方法，近年來，它被越來越多的應(yīng)用于探討功能基因表達(dá)量變化的研究中。運(yùn)用熒光定量PCR研究基因表達(dá)時(shí)，需要內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)過程進(jìn)行校正，因此選擇合適的內(nèi)參基因?qū)τ诘贸鰷?zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重要的意義。本研究中共選用了8個(gè)候選內(nèi)參基因：Actin（肌動(dòng)蛋白），EF1α（翻譯延伸因子1α亞基），UBA80（泛素融合蛋白80），GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶），UBA52（泛素融合蛋白52

2、），18S（核糖體18S亞基），TUA（微管蛋白α亞基），TUB（微管蛋白β亞基）。這些管家基因都是古老的基因，在生物界中廣泛分布。
　　在褐藻中除了水云基因組大規(guī)模測序注釋分析中所獲得的序列，還未見對這些管家基因克隆的報(bào)道。本研究對除18S外的另7個(gè)基因在海帶中首次成功進(jìn)行了cDNA水平上的克隆，所獲得的7個(gè)基因序列長度分為：Actin，1131bp；EF1α，1323bp；α-Tubulin，1362bp；β-Tubulin，

3、1341bp；GAPDH，1002bp；UBA80，468bp；UBA52，387bp，相應(yīng)的GC含量分別為62.8％，61.5%，65.4%，62.4%，59.4%，62.9%，59.9%，它們在各種藻類（紅藻、褐藻、綠藻、硅藻、隱藻、灰胞藻、定鞭藻）、高等植物、原生動(dòng)物、原核生物和古菌中都有廣泛的分布。因此運(yùn)用上述序列對部分內(nèi)參基因（Actin，EF1α，GAPDH，TUA，TUB）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明這些基因的起源都不盡相同，

4、它的起源進(jìn)化包含了復(fù)雜的生物學(xué)事件。
　　本研究在海帶不同組織部位及不同生長時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性。通過熒光定量PCR得到各基因在各樣品中的Ct值，然后通過對原始Ct值的統(tǒng)計(jì)分析，以及利用三種內(nèi)參篩選軟件（geNorm，NormFinder和Bestkeeper）對Ct值進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在海帶不同組織部位中，geNorm的分析結(jié)果顯示候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低為：EF1α，UBA80，TUA，GAPDH，TUB，UBA52，18S

5、，Actin；NormFinder的分析結(jié)果顯示候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低為：EF1α，UBA80，TUA，GAPDH，TUB，UBA52，18S，Act；Bestkeeper分析結(jié)果顯示UBA80和EF1α的穩(wěn)定性最好，而Actin在這三種軟件的分析中穩(wěn)定性均為最差。因此，在海帶不同組織部位中，EF1α和UBA80為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合。在海帶的不同生活時(shí)期中，geNorm的分析結(jié)果顯示候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低為UBA80，EF

6、1α，Actin，TUA，TUB，UBA52，GAPDH，18S；NormFinder的分析結(jié)果顯示候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低為UBA80，TUB，EF1α，UBA52，TUA，Actin，GAPDH，18S；Bestkeeper分析結(jié)果顯示UBA80和TUB的穩(wěn)定性較好，因此，在海帶不同生活時(shí)期中，UBA80和TUB為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合。而18S雖然自身表達(dá)量較為穩(wěn)定，但是與其它候選內(nèi)參基因的匹配度很差，因此不適宜作為雙內(nèi)參或多內(nèi)