三角褐指藻三酰基甘油合成相關基因的功能驗證.pdf

1、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)已完成基因組測序,具備成熟的遺傳轉化技術,是海洋硅藻的模式種。由于其生長快、油脂含量高(占細胞干重的20％～50%),具備大規(guī)模培養(yǎng)的技術基礎,已成為微藻生物柴油研究的理想材料。本文對其三?；视?TAG)合成的關鍵基因進行了克隆,并在相應酵母缺陷型菌株中開展了功能驗證,進一步構建了硅藻表達載體,完成了基因槍轉化,取得進展如下:
　　1.通過RT-PCR方法從三角褐指

2、藻總cDNA中克隆得到磷酸甘油?；D移酶1(PtGPAT1)基因的完整cDNA序列,通過與基因組序列比較分析,發(fā)現該基因序列全長1947bp,編碼648個氨基酸,基因組全序列共有5個外顯子和4個內含子,利用信息學方法分析共有6個跨膜結構,分析該GPAT定位于內質網。
　　2.針對PtGPAT1與實驗室之前克隆的二酰甘油?；D移酶2基因(PtDGAT2),構建了酵母表達載體pYGPAT1與pYDGAT2,導入后分別在2株GPAT(Y

3、13037、Y15983)和1株DGAT(H1246)缺陷型酵母菌株中進行相關基因的功能驗證。尼羅紅染色觀察顯示,PtGPAT1在2種酵母缺陷型轉化子中的相對熒光值均顯著高于轉化空白載體的對照組,證明PtGPAT1重組表達蛋白具備磷酸甘油?；D移酶活性。而PtDGAT2不能使DGAT缺陷性釀酒酵母H1246回復突變,提示不具備二酰甘油?；D移酶功能。
　　3.針對PtDGAT2與實驗室之前在酵母中已驗證功能的二酰甘油酰基轉移酶4(

4、PtDGAT4),構建了硅藻表達載體pfcpA-DGAT2/pfcpB-Bar和pfcpA-DGAT4/pfcpB-Bar,并完成了基因槍轉化,后續(xù)抗性藻株的篩選與檢測實驗正在進行中。
　　本文首次對三角褐指藻的GPAT基因完成功能驗證,相對熒光值半定量結果顯示,PtGPAT1可以顯著提高酵母缺陷型菌株中的TAG含量,提示PtGPAT1可以作為三角褐指藻油脂代謝基因工程的重要靶基因。構建了PtDGAT2與PtDGAT4的硅藻轉化載