水牛早期胚胎發(fā)育蛋白質(zhì)糖基化機(jī)理及轉(zhuǎn)基因克隆的研究.pdf

1、本研究主要探討O-GlcNAc糖基化在水牛胚胎早期發(fā)育過程中的作用機(jī)理和水牛轉(zhuǎn)基因克隆的相關(guān)影響因素，以便建立一套較為完善的水牛轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)體系。具體的研究結(jié)果如下：
　　 ⑴建立了水牛早期胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白和(beta-O-linkedN-glycosylation，O-GlcNAcylation)相關(guān)基因的表達(dá)檢測方法。免疫熒光染色抗體濃度優(yōu)化的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一抗?jié)舛葹?∶200，二抗?jié)舛葹?∶1000時(shí)，可

2、清晰地觀察到經(jīng)抗體免疫后O-GlcNAc蛋白的分布，可用于O-GlcNAc蛋白的表達(dá)情況檢測分析。為建立O-GlcNAc糖基化相關(guān)基因（GFPT、OGT和OGA）的mRNA表達(dá)熒光定量PCR檢測分析方法，根據(jù)NCBI中GenBank所提供的人或牛GFPT、OGT、OGA基因的CDS序列設(shè)計(jì)水牛相關(guān)基因的PCR引物，克隆得到水牛的GFPT、OGT和OGA基因CDS序列，然后根據(jù)該序列設(shè)計(jì)合成實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。結(jié)果顯示，PCR的CDS

3、產(chǎn)物無雜帶，條帶均一，為特異性的目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物;QRT-PCR的熔解溫度均一，熔解曲線表現(xiàn)為尖銳的單一峰，證實(shí)引物的有效性，說明該QRT-PCR體系可用于檢測水牛早期胚胎GFPT、OGT和OGA基因的表達(dá)。
　　 ⑵以水牛孤雌激活(PA)、體外受精(IVF)和體細(xì)胞核移植(SCNT)早期胚胎為研究對象，研究分析了水牛早期胚胎發(fā)育過程中O-GlcNAc蛋白及相關(guān)基因(GFPT、OGT和OGA)的表達(dá)模式。免疫熒光染色結(jié)果顯示，水

4、牛PA、IVF和SCNT胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白水平呈現(xiàn)相似地變化趨勢，即從2-細(xì)胞期開始慢慢增加，到囊胚期達(dá)到最高;其中，IVF胚胎各階段O-GlcNAc蛋白水平均顯著高于SCNT和PA組（P＜0.05），而SCNT胚胎各發(fā)育階段O-GlcNAc蛋白水平顯著高于PA組(P＜0.05)。QRT-PCR的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水牛PA、IVF和SCNT胚胎的GFPT基因mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，即從2-細(xì)胞到4-Cell期表達(dá)

5、量升至最高，然后逐漸下降，到囊胚期達(dá)到最低;其中，GFPT的表達(dá)量在IVF胚胎各時(shí)期中表達(dá)量最高，均顯著高于PA和SCNT胚胎組(P＜0.05)，而SCNT胚胎組在8-細(xì)胞期后GFPT的表達(dá)量顯著高于PA組(P＜0.05)。OGT基因的mRNA表達(dá)量隨著胚胎的發(fā)育逐漸增加，至囊胚期達(dá)到最高;其中，IVF胚胎各階段OGT的mRNA表達(dá)量均顯著高于PA胚胎(P＜0.05)，而在8-細(xì)胞期和桑椹胚期顯著高于SCNT胚胎（P＜0.05）。OGA

6、基因的mRNA表達(dá)量從2-細(xì)胞期到4-細(xì)胞期呈下降趨勢，而后又逐漸升高，到8-細(xì)胞期表達(dá)量達(dá)到最高，而后開始下降，到囊胚期降到最低，且IVF各個(gè)發(fā)育時(shí)期的胚胎OGA的mRNA表達(dá)量顯著高于PA胚胎(P＜0.05)，但SCNT的8-細(xì)胞期和囊胚期胚胎OGA的mRNA表達(dá)量顯著低于IVF胚胎（P＜0.05）。
　　 ⑶研究探討了糖基化底物—氨基葡糖(glucosamine，GlcN)對水牛早期胚胎發(fā)育、O-GlcNAc蛋白及相關(guān)基因

7、表達(dá)水平的影響。當(dāng)在PA、IVF和SCNT胚胎培養(yǎng)的0～72 h添加不同濃度的GlcN(0、1、2和4 mmol/L)時(shí)，2 mmol/L組的囊胚率均顯著高于對照組(23.75％vs13.38％;26.16％ vs14.29％;25.52％ vs12.70％, P＜0.05)，而各組之間分裂率差異不顯著(P＞0.05)。IF染色觀察的結(jié)果顯示，在各類水牛早期胚胎培養(yǎng)的0～72 h添加2 mmol/L GlcN，PA胚胎發(fā)育各階段O-Gl

8、cNAc蛋白水平顯著高于對照組(P＜0.05);IVF胚胎除囊胚期外，其它各發(fā)育階段O-GlcNAc蛋白水平均顯著高于對照組(P＜0.05);SCNT胚胎除8-細(xì)胞和桑椹胚期外，其它各發(fā)育階段均顯著高于對照組(P＜0.05)。QRT-PCR檢測結(jié)果顯示，在水牛胚胎培養(yǎng)的0～72 h添加2 mmol/L GlcN，PA胚胎各發(fā)育時(shí)期的GFPT基因mRNA表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05）;而IVF胚胎在4-細(xì)胞期和SCNT胚胎在4-細(xì)

9、胞和8-細(xì)胞期的GFPT表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05），其它各發(fā)育階段與對照組差異均不顯著(P＞0.05)。在胚胎OGT的表達(dá)方面，PA胚胎2 mmol/L GlcN添加組在4-細(xì)胞期、IVF胚胎在囊胚期和SCNT胚胎2-細(xì)胞期和囊胚期的OGT表達(dá)量與對照組差異不顯著(P＞0.05)，其余各階段的OGT表達(dá)量均顯著高于對照組(P＜0.05)。在胚胎OGA的表達(dá)方面，IVF胚胎2 mmol/LGlcN添加組在4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期

10、、桑椹胚和囊胚期，SCNT胚胎在4-細(xì)胞期OGA表達(dá)量與對照組差異不顯著（P＞0.05），其它各階段均顯著低于對照組(P＜0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，在水牛胚胎發(fā)育0～72 h間添加適宜濃度的O-GlcNAc蛋白糖基化底物(2mmol/L GlcN)有利于提高早期胚胎的發(fā)育能力;而且也可以促進(jìn)早期胚胎O-GlcNAc蛋白的表達(dá)，上調(diào)OGT和GFPT基因，下調(diào)OGA基因的表達(dá)水平，從而促進(jìn)胚胎的發(fā)育。
　　 ⑷主要探討了影響供體細(xì)胞轉(zhuǎn)染

11、效率及轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育的相關(guān)因素。電穿孔法、脂質(zhì)體法、磷酸鈣法及慢病毒法轉(zhuǎn)染水牛胎兒成纖維細(xì)胞(BFF)篩選獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核移植供體的研究結(jié)果顯示，電穿孔法構(gòu)建的重構(gòu)胚表達(dá)標(biāo)記基因EGFP的陽性分裂率(48.00％)和陽性囊胚率(18.58％)極顯著高于磷酸鈣法（0％和0％）、慢病毒介導(dǎo)法（0％和0％）和脂質(zhì)體包埋法（5.60％和3.72％）。采用電穿孔法二次轉(zhuǎn)染BFF，其重構(gòu)胚分裂率和囊胚率均略高于一次轉(zhuǎn)染，但是差異不顯著(7

12、1.23％ vs68.37％;24.66％ vs18.37％，P＞0.05)。將內(nèi)部核糖體接入位點(diǎn)(IRES)插入到表達(dá)載體與未插入IRES基因的表達(dá)載體比較發(fā)現(xiàn)，表達(dá)載體pEGFP-IRES-NEO的轉(zhuǎn)基因克隆重構(gòu)胚分裂率、陽性分裂率、陽性囊胚率均顯著高于pEGFP-N1表達(dá)載體(71.43％ vs57.77％;39.14％ vs8.35％;17.64％ vs5.20％, P＜0.01)。將pEGFP-IRES-NEO表達(dá)載體進(jìn)行單切

13、或雙切后分別轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞，單切載體重構(gòu)胚的陽性分裂率和陽性囊胚率高于雙酶切載體，但兩組間差異不顯著（37.39％ vs32.41％;9.66％vs8.30％，P＞0.05）。同時(shí)，在比較不同代數(shù)（6-10代）的供體細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆重構(gòu)胚時(shí)發(fā)現(xiàn)，重構(gòu)胚早期胚胎分裂和囊胚期EGFP表達(dá)率差異不顯著（P＞0.05）。不同性別的供體細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFP基因用于構(gòu)建核移植重構(gòu)胚的結(jié)果顯示，雌性細(xì)胞組陽性分裂率和陽性囊胚率顯著高于雄性供體細(xì)胞組(67

14、.63％ vs42.76％;22.54％ vs10.52％，P＜0.05)，分裂率和囊胚率也高于雄性供體細(xì)胞組，但差異不顯著(71.10％ vs68.42％;26.59％ vs21.71％，P＞0.05)。將得到的含有EGFP基因的6-8天囊胚進(jìn)行胚胎移植，得到了表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因克隆水牛5頭，雙胞胎中的一頭不幸死亡。經(jīng)過鑒定確認(rèn)轉(zhuǎn)基因克隆水牛表達(dá)EGFP基因。此外，用轉(zhuǎn)干擾素(IFN)、生長素(GH)、促乳素(PRL)基因的供體細(xì)胞

15、進(jìn)行核移植，三種基因的轉(zhuǎn)基因克隆胚胎分裂率、陽性分裂率、囊胚率和陽性囊胚率差異均不顯著(66.44％ vs62.50％、59.23％;54.11％ vs57.35％、51.63％;17.81％ vs19.12％、20.65％;16.44％ vs13.60％、14.67％，P＞0.05），且經(jīng)胚胎移植給受體水牛后獲得妊娠。上述結(jié)果表明：①電穿孔法較磷酸鈣法、脂質(zhì)體法和慢病毒轉(zhuǎn)染法更適合制備轉(zhuǎn)基因克隆水牛，使用該法能獲得轉(zhuǎn)基因克隆水牛；②水

16、牛轉(zhuǎn)基因克隆效率受供體細(xì)胞性別的影響，雌性胎兒成纖維細(xì)胞優(yōu)于雄性，但不受供體細(xì)胞轉(zhuǎn)染次數(shù)、代數(shù)以及載體的酶切方法的影響；③攜帶GH、IFN和PRL的轉(zhuǎn)基因載體能夠用于水牛轉(zhuǎn)基因克隆胚胎生產(chǎn)，且胚胎移植后均可以在體內(nèi)妊娠并進(jìn)一步發(fā)育。
　　 ⑸探討了Trichostatin A(TSA)處理供體細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因克隆重構(gòu)胚對水牛轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)EGFP及克隆重構(gòu)胚發(fā)育的影響。流式細(xì)胞儀檢測分離、純化后的供體細(xì)胞結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)EGFP供體

17、細(xì)胞代數(shù)的增加（7-11代），表達(dá)EGFP細(xì)胞的數(shù)目有所降低，差異不顯著(P＞0.05)。將轉(zhuǎn)EGFP基因的細(xì)胞分別用濃度為5 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L TSA處理24 h后顯著提高細(xì)胞G0/G1期的比例，且從10 nmol/L起表達(dá)EGFP細(xì)胞的數(shù)目開始顯著地增加(P＜0.05)。TSA濃度為5nmol/L、10 nmol/L時(shí)，乙?；斤@著高于對照組(P＜0.05)，且供體細(xì)胞DNA

18、甲基化水平顯著低于對照組(P＜0.05)。TSA處理24 h供體細(xì)胞后進(jìn)行核移植的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSA濃度為10 nmol/L時(shí)，重構(gòu)胚的分裂率(85.71％ vs60.40％)、陽性分裂率(84.82％ vs55.45％)、囊胚率(49.11％ vs26.73％)和陽性囊胚率(49.11％ vs21.78％)顯著高于對照組(P＜0.05)。將轉(zhuǎn)基因克隆重構(gòu)胚后用5 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L或100 nmol/L

19、的TSA處理6h后發(fā)現(xiàn)，50 nmol/L TSA組的重構(gòu)胚的分裂率(83.33％ vs69.70％)、陽性分裂率(82.41％ vs60.61％)、囊胚率(45.37％ vs29.29％)和陽性囊胚率(43.52％ vs21.21％)均顯著高于對照組(P＜0.05)。用50 nmol/L TSA對重構(gòu)胚分別處理3h、6h、9h或12 h后發(fā)現(xiàn)，處理時(shí)間為9h的重構(gòu)胚分裂率(86.17％ vs74.31％)、陽性分裂率(82.20％ v

20、s70.64％)、囊胚率(49.15％ vs33.94％)和陽性囊胚率(47.46％ vs32.11％)均顯著高于對照組(P＜0.05)，其余各組與對照組相比差異不顯著。此外，水牛轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的乙?；郊跋嚓P(guān)基因的表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示，50nmol/L TSA處理重構(gòu)胚9h，能顯著提高胚胎的乙酰化水平(P＜0.05)，顯著提高HAT1基因的表達(dá)(P＜0.05)，顯著降低HDAC1基因的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 ⑹研究結(jié)果

21、表明：①轉(zhuǎn)EGFP的水牛胎兒成纖維細(xì)胞隨著細(xì)胞代數(shù)的增加（7-11代），表達(dá)EGFP細(xì)胞的數(shù)目呈逐漸降低的趨勢；②采用10 nmol/L的TSA處理供體細(xì)胞24 h不但可以顯著提高轉(zhuǎn)EGFP基因水牛胎兒成纖維細(xì)胞處于G0/G1期的比例和表達(dá)EGFP細(xì)胞的數(shù)量，而且能提高細(xì)胞組蛋白H3K14組蛋白乙?；?，且降低細(xì)胞DNA甲基化水平，提高其核移植后的轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的體外發(fā)育率；③適當(dāng)濃度(50 nmol/L)的TSA處理水牛轉(zhuǎn)基因克隆重