流行性乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、流行性乙型腦炎簡稱乙腦，是由黃病毒科黃病毒屬的乙腦病毒(也稱日本腦炎病毒，Japaneseencephalitis virus，JEV)引起、由蚊蟲傳播的一種急性病毒性傳染病，主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對人類健康威脅很大。對豬可引起繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬是JEV的中間宿主，帶毒豬是本病的主要傳染源。因此，控制豬的JE不僅對養(yǎng)豬業(yè)而且對人類健康都具有十分重要的意義。 E蛋白是JEV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的吸附、融合

2、、血凝、細(xì)胞趨向性、病毒毒力和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)中起重要作用。本研究首先利用原核表達(dá)的乙型腦炎病毒SA14-14-2株結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白作為免疫原，免疫6周齡BALB/c小鼠，采用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，經(jīng)有限稀釋法共獲得15株特異性針對JEVE蛋白的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1A9、1G12、1H2、2A6、283、2G3、3D1、4E6、4H1、5B3、587、5D4、5D7、5G11、5G12，經(jīng)測定587單抗亞類屬于IgG2b，5D

3、4和SG12的單抗亞類屬于IgG2a,其余12株均為IgG1，輕鏈均為κ鏈。經(jīng)Western blot證實所得雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均可特異地與JEV E蛋白反應(yīng)。結(jié)果表明，所制備的抗重組JEV E蛋白的單抗對病原檢測具有很高的特異性，為JEV準(zhǔn)確快速的病原診斷和JEV感染相關(guān)的基礎(chǔ)性研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 由于鼠源性單抗在治療時引起了嚴(yán)重的HAMA(human anti-mouse antibody)反應(yīng)，限制了臨床的運(yùn)用，為了克

4、服鼠源MAb的免疫源性，使之和人體分子有非常相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別，降低或避免誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)。采用基因工程方法制備單鏈抗體免除了雜交瘤技術(shù)繁雜的篩選過程，拓寬了抗體的應(yīng)用范圍，大大推進(jìn)了抗體工程的進(jìn)展。本試驗從分泌抗乙腦病毒E蛋白特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株5D4中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)克隆抗乙腦病毒E蛋白單抗5D4 VH基因，并將其插入pMD18-T載體中進(jìn)行測序分析。VH基因全長328 bp。通過分析，這些基