兩株溶藻弧菌對(duì)對(duì)蝦抗WSSV感染作用差異的分子作用機(jī)制的研究.pdf

1、益生菌在水產(chǎn)界以得到了廣泛的應(yīng)用和認(rèn)可,也以逐步成為了對(duì)蝦控制病害的主要手段之一?，F(xiàn)階段，對(duì)于益生菌開(kāi)發(fā)的種類(lèi)已經(jīng)非常的豐富，但是益生菌的作用機(jī)制，還不是很清楚，多處于摸索階段。溶藻弧菌產(chǎn)益生菌以作為水被認(rèn)可和應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)室已有對(duì)溶藻弧菌投喂飼料對(duì)對(duì)蝦抗WSSV感染的研究結(jié)果差異為依據(jù)，不同溶藻弧菌菌株對(duì)對(duì)蝦抗WSSV的作用相差很大，本研究通過(guò)兩株菌株的差異比較，本研究通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)手段，尋找到菌株間存在的胞外、胞內(nèi)蛋白、多

2、糖之間的差異，進(jìn)一步確定兩株菌株的胞外蛋白中的絲氨酸蛋白酶、胞外多糖等物質(zhì)存在明顯的差異。通過(guò)結(jié)果顯示，溶藻弧菌的胞外產(chǎn)物對(duì)對(duì)蝦抗病作用具有重要的價(jià)值。本研究為益生菌的篩選起到了一定的指示作用，并對(duì)益生菌的發(fā)酵和益生菌中的代謝產(chǎn)物中有價(jià)值的物質(zhì)的進(jìn)一步利用提供了一定的參考價(jià)值。
　　本實(shí)驗(yàn)共分為幾部分：利用16S技術(shù)、16-23S技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，利用SDS-PAGE,質(zhì)譜技術(shù)對(duì)菌體蛋白、外膜蛋白、胞外分泌蛋白及胞外多糖進(jìn)行分離

3、及種類(lèi)鑒定，對(duì)差異蛋白進(jìn)行人工重組誘導(dǎo)純化，通過(guò)養(yǎng)殖侵染免疫實(shí)驗(yàn)，免疫作用驗(yàn)證蛋白的功能。
　　內(nèi)容和方法分為以下幾個(gè)方面：
　　1、通過(guò)16sDNA分子基因序列分析、結(jié)合16S-23RDNA分子手段將兩株溶藻弧菌鑒定到亞種。確定兩株分離自凡納濱對(duì)蝦腸道的兩株菌為溶藻弧菌不同株，其16-23SRNA之間存在差異對(duì)于細(xì)菌的鑒定還有很多技術(shù)手段。
　　2、利用16S-23rDNA分子手段及RFLP技術(shù)將多株溶藻弧菌鑒定進(jìn)行

4、鑒定。將分離的多株溶藻弧菌的鑒定還有很多技術(shù)手段，利用 RFLP技術(shù)將16-23SrDNA不能分離的菌株得到了進(jìn)一步的分離，該分子手段結(jié)合很好的將亞種進(jìn)一步的得到了分離，為溶藻弧菌的菌株鑒定進(jìn)行具有一定的作用。
　　3、通過(guò) SDS-PAGE、質(zhì)譜分析等手段對(duì)溶藻弧菌進(jìn)行蛋白的分離，找出差異蛋白，進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定出蛋白條帶差異帶為絲氨酸蛋白酶，絲氨酸蛋白酶為免疫中的重要物質(zhì)，具有天然的抗病毒作用，進(jìn)一步推測(cè)溶藻弧菌中的胞外產(chǎn)

5、物中的絲氨酸蛋白酶具有抗病毒對(duì)蝦WSSV的作用，但由于其占胞外總蛋白含量較低，推測(cè)其絲氨酸蛋白酶的作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　4、通過(guò)SDS-PAGE、質(zhì)譜分析等手段對(duì)溶藻弧菌全蛋白進(jìn)行蛋白的分離，找出差異蛋白通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定出蛋白條帶為鐵載體蛋白，通過(guò)人工重組鐵蛋白質(zhì)粒技術(shù)，將FER基因克隆并表達(dá)至載體pBAD/gIIIA中，構(gòu)成重組載pBAD/gIIIA-FER之質(zhì)粒。將重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10中進(jìn)行原核表達(dá)，純化得到人

6、工重組鐵載體蛋白,在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下，通過(guò) Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,得到預(yù)期的目標(biāo)蛋白，證實(shí)重組表達(dá)蛋白實(shí)驗(yàn)成功。
　　5、通過(guò)利用人工合成的重組細(xì)菌，在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下，對(duì)于鐵蛋白的功能進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明鐵蛋白本身只是有一定的提高免疫的作用，推遲對(duì)蝦的半數(shù)致死時(shí)間，最后免疫反應(yīng)侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果全部死亡，進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)菌鐵載體本身主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)鐵離子抑制其他細(xì)菌的繁殖，而該蛋白不能完全達(dá)到溶藻弧菌整體的作用效果，也進(jìn)一步說(shuō)

7、明益生菌應(yīng)用的本身是通過(guò)整體的作用達(dá)到益生的效果。
　　6、通過(guò)利用細(xì)菌胞外多糖提取技術(shù)，得出兩株菌株之間的胞外多糖的產(chǎn)出率存在較大差異，雖然只有對(duì)于乳酸桿菌胞外多糖免疫作用的研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)進(jìn)一步證實(shí)溶藻弧菌代謝產(chǎn)物中的多糖物質(zhì)應(yīng)該是這兩株溶藻弧菌產(chǎn)生對(duì)對(duì)蝦抗WSSV的作用差異的關(guān)鍵因素，為益生菌的有益產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)、利用具有重要作用，為益生菌對(duì)蝦抗WSSV的防治提供了理論基礎(chǔ)。
　　綜上所述，我們可以得出以下結(jié)