日本對蝦類甲殼肽(crustin-like)基因在溶藻弧菌和白斑綜合征病毒感染過程中的作用機制研究.pdf

1、抗菌肽是在甲殼動物先天性免疫中發(fā)揮重要作用的幾類小分子肽的總稱，其中crustin是很重要的一類抗菌肽。本研究中，我們旨在研究日本對蝦（MarsupenaeusJaponicus）在感染白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)或溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）時，類甲殼肽(crustin-like)基因所發(fā)揮的免疫功能。通過cDNA末端快速擴增技術(Rapid Amplifica

2、tion of cDNA Ends，RACE)，從日本對蝦體內克隆到一條全長為660 bp的cDNA序列，軟件推測分析顯示該基因的開放閱讀框大小為507bp，編碼一個含有168個氨基酸殘基的蛋白，基因3'末端含有一條Poly(A)尾巴，5'和3'的非編碼區(qū)分別為72 bp和81 bp，推測出蛋白質的相對分子質量為16.22 kDa，pI為8.37。氨基酸序列比對和進化樹分析顯示crustin-like基因主要存在于甲殼動物中的對蝦及少部

3、分螃蟹中，其中在日本對蝦發(fā)現(xiàn)的crutstin-like與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)親緣關系較近。
　　通過實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測基因表達的組織特異性發(fā)現(xiàn)crustin-like在鰓內表達量最高，在血淋巴、肝胰腺、肌肉和消化腺內表達量較低。通過double-strand RNA(dsRNA)干擾技術，體外構建dsRNA表達載體，將純化

4、后的dsRNA注射到對蝦體內，成功地抑制了crustin-like基因的表達。對已知重要的免疫相關基因的檢測結果顯示，在crustin-like被沉默后，對蝦先天性免疫系統(tǒng)中多個免疫相關基因的表達受到影響，其中Immune deficiency homolog(IMD)、Rab7、L-lectin、mitogen-activated protein kinase(MAPK)、p53、prophenoloxidase(proPO)和Rho

5、基因的表達顯著下調，而nitric oxide synthase(NOS)、myosin及Tumor necrosisfactor-α（TNF-α）基因的表達顯著上調。對蝦免疫活性試驗顯示，在抑制crustin-like基因的表達后，對蝦血細胞總數(shù)顯著減少，酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著減低。以上結果說明crustin-like對細胞吞噬作用、凋亡和部分免疫通路有顯著的影響。
　　進一步研究發(fā)現(xiàn)，在感染溶藻弧菌

6、后，crustin-like基因的表達顯著上調。統(tǒng)計死亡率發(fā)現(xiàn)，沉默crustin-like基因的表達后，對蝦感染弧菌后累計死亡率顯著增加。結果說明對蝦crustin-like有明顯的抗弧菌的作用。血細胞吞噬試驗結果顯示，對蝦crustin-like基因被沉默后，對蝦血細胞對溶藻弧菌的吞噬率顯著升高，血淋巴細胞凋亡率顯著升高，結果說明溶藻弧菌在感染對蝦時可能會利用crustin-like來逃避對蝦血細胞對弧菌的吞噬作用，這一現(xiàn)象還有待進

7、一步的研究。
　　在感染W(wǎng)SSV后12-72 h，crustin-like基因的表達顯著升高。WSSV拷貝數(shù)檢測和Kaplan-Meier生存分析結果顯示crustin-like基因被沉默后，WSSV拷貝數(shù)顯著降低，對蝦存活率顯著升高。抑制crustin-like基因的表達后，對蝦血細胞對WSSV的吞噬率顯著降低，對蝦血細胞的凋亡顯著升高。以上結果說明對蝦crustin-like可以抑制細胞凋亡，而WSSV有可能利用crustin