對(duì)蝦Coat-ε、CCAP17和CHC的克隆、表達(dá)及其在WSSV感染中的作用.pdf

1、分類號(hào) 分類號(hào) 密 級(jí) U D C

2、 編 號(hào) 碩 士 學(xué) 位 論 文 對(duì)蝦 Coat-ε、CCAP17 和 CHC 的克隆、表達(dá)及其在 WSSV 感染中的作用 王修芳 （20132043） 指導(dǎo)教師姓名 吳垠教授 專 業(yè) 名 稱 生理學(xué) 論文答辯日期 2016 年 6 月 2 日 學(xué)位授予日期 2016 年 6 月 摘要 I 摘要 本文以中國(guó)明對(duì)蝦 Coat-ε、凡納濱對(duì)蝦 Clathrin c

3、oat AP17 和對(duì)蝦 Clathrin heavy chain（CHC）為研究對(duì)象，分別克隆出它們的基因序列全長(zhǎng)，并進(jìn)一步研究了它們?cè)?WSSV侵染中的作用。主要包括以下三個(gè)部分： 第一部分：采用 cDNA 末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA end, RACE）技術(shù)，擴(kuò)增出中國(guó)明對(duì)蝦 Coat-ε 基因的 3’端和 5’端序列，拼接獲得基因全長(zhǎng)序列 1402 bp，其中開放閱讀框 1008 bp,

4、 預(yù)測(cè)編碼 335 個(gè)氨基酸，此氨基酸沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。coat-ε 在各組織中都有表達(dá)，肌肉中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量最高。構(gòu)建了 coat-ε 重組表達(dá)載體，SDS-PAGE 檢測(cè)表達(dá)的蛋白顯示條帶與預(yù)期大小相符，質(zhì)譜分析確認(rèn)重組蛋白為 Coat-ε。Far-Western blotting 和 ELISA 分析顯示 Coat-ε 蛋白與 WSSV 結(jié)構(gòu)蛋白 VP26、VP28N、VP28C 有結(jié)合作用。流式細(xì)胞分析及細(xì)

5、胞 ELISA 結(jié)果表明，Coat-ε 蛋白抗體抑制 WSSV 與血細(xì)胞的結(jié)合，體內(nèi)中和試驗(yàn)表明 Coat-ε 與 WSSV 及其早期基因 ie1 和晚期基因 vp28 基因表達(dá)密切相關(guān)，Coat-ε 抗體延緩了 WSSV 對(duì)對(duì)蝦的感染。 第二部分：采用 RACE 法擴(kuò)增出凡納濱對(duì)蝦 Clathrin coat AP17 (LvCCAP17)的 3’端和5’端序列，序列全長(zhǎng) 842bp，預(yù)計(jì)編碼 142 個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析表明此氨

6、基酸沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。熒光定量 PCR 分析 LvCCAP17 在凡納濱對(duì)蝦各組織中均有表達(dá)。感染 WSSV 后在上皮和肝胰腺組織中 LvCCAP17 轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量明顯上升。構(gòu)建 LvCCAP17 重組表達(dá)載體，SDS-PAGE 檢測(cè)表達(dá)的蛋白顯示條帶與預(yù)期大小相符，質(zhì)譜分析確認(rèn)重組蛋白為 CCAP17。Far-Western blotting 和 ELISA 分析顯示，LvCCAP17 與 WSSV 的結(jié)構(gòu)蛋白

7、 VP26、VP37 具有結(jié)合作用。RNA 干擾（RNAi）實(shí)驗(yàn)表明 AP17 基因沉默后，感染 WSSV 的對(duì)蝦累積死亡率降低，并且 ie1 和 VP28 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)下降。這些結(jié)果顯示，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用參與 WSSV 的感染。 第三部分：通過 GeneBank 上發(fā)布的斑節(jié)對(duì)蝦網(wǎng)格蛋白重鏈（CHC）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增中國(guó)明對(duì)蝦網(wǎng)格蛋白重鏈（Fenneropenaeus chinensis clathrin heavy chain

8、，F(xiàn)cCHC）和凡納濱對(duì)蝦網(wǎng)格蛋白重鏈（Litopenaeus vannamei clathrin heavy chain, LvCHC）序列全長(zhǎng)。獲得 LvCHC 和 FcCHC 序列全長(zhǎng)是 5052 bp，預(yù)計(jì)編碼 1684 個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，LvCHC 和 FcCHC 均為疏水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，LvCHC 和 FcCHC 的功能域與其它物種有差別。RNAi 實(shí)驗(yàn)表明，CHC 沉默后，凡納濱對(duì)蝦感染 WSSV