硫氧還原蛋白與腫瘤蛋白在WSSV感染中作用及凡納濱對蝦感染WSSV后代謝物的變化.pdf

1、白斑綜合征病毒（WSSV）是一個嚴重影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的病毒，它于1992年首先發(fā)現(xiàn)于東南亞地區(qū)，此后相繼在世界范圍內傳播開來。由于其可以侵染的宿主范圍非常廣泛，所以每年都會給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失。該病毒可以侵入多種宿主，包括多種水產動物，如對蝦、蟹、淡水蝦和小龍蝦、以及水生節(jié)肢動物和浮游動物[5-6]。
　　本實驗擬通過分子生物學以及蛋白質組學的一些方法，來研究硫氧還原蛋白 Thiordoxin（TRX）和腫瘤蛋白onopr

2、otein（OP）與WSSV的作用情況，并通過1H NMR核磁共振光譜分析法分析感染了WSSV的凡納濱對蝦代謝產物的變化情況，以及TRX、LvP38、CAT和POD四種基因在凡納濱對蝦感染了WSSV后的變化情況，從而來進一步的探討WSSV的治病機理[1-4]。
　　Part1：硫氧還原蛋白Thiordoxin（TRX），是一個重要的細胞內抗氧化蛋白，它具有一系列生物學功能。有研究表明，TRX的基因表達量在感染 WSSV的動物體內呈

3、上升趨勢。然而，TRX在 WSSV感染中的作用及對相關信號通路的影響尚不清楚。序列分析表明，TRX可以與WSSV上的結構蛋白WSSV030（VP362）和WSSV454（TK-TMK）相互作用。本部分通過原核表達成功獲得TRX、VP362和TK，并用Far western blot和ELISA方法證明他們之間確實可以相互作用。通過絕對定量以及相對定量的分析表明，TRX蛋白的過表達可促進IKK、LvP38和STAT這些免疫相關的基因和細胞

4、信號通路的相關基因在感染WSSV對蝦體內的基因表達量，并且在WSSV感染對蝦體內，TRX基因與VP28基因的相對表達量呈正相關。體外中和試驗表明 TRX在對蝦體內過表達后，可加快 WSSV在對蝦體內的復制，并加快感染WSSV的對蝦的死亡，說明TRX具有促進WSSV感染的作用。
　　Part2：本部分實驗主要研究腫瘤蛋白（oncoprotein）OP（與NDK序列相同）與WSSV的作用關系。首先通過原核表達獲得 OP表達產物，親和層

5、析純化出 OP蛋白。采用Far western blot和ELISA方法研究OP與WSSV結構蛋白的作用，結果表明OP與WSSV膜蛋白 VP28有相互作用。然后再通過體外注射 OP蛋白于凡納濱對蝦體內，測量病毒拷貝數以及mRNA水平上IE1和VP28基因的相對表達量，結果表明OP蛋白可促使WSSV在對蝦體內的復制，并促使WSSV感染的對蝦體內的IE1和VP28基因表達量升高。體內中和試驗表明，注射OP蛋白的感染WSSV的對蝦，死亡時間早

6、于其他實驗對照組。RNA干擾實驗表明，注射dsRNA-OP的感染組對蝦，死亡時間明顯延后于正常感染WSSV的對蝦和其他實驗對照組。由此推斷，OP蛋白可以加快WSSV在對蝦體內的增殖，且OP蛋白可能是一種WSSV促死蛋白。
　　Part3：本部分實驗通過1H NMR光譜分析法分析感染WSSV的凡納濱對蝦和健康的對蝦的代謝差異。實驗內容主要是各取WSSV感染48h后的對蝦和注射PBS緩沖液48 h后的健康對蝦的肝胰腺組織進行NMR和多

7、元數據分析（包括主成分分析PCA，正交偏最小二乘分析模型OPLS-DA modle），發(fā)現(xiàn)與健康對蝦相比，WSSV感染的對蝦的肝胰腺組織中，醋酸鹽、脂質（-CH2-CH=CH-）、賴氨酸、酪氨酸、N-乙?；堑鞍椎暮亢艿?，而α-葡萄糖和β-葡萄糖的含量則非常高，這表明WSSV感染干擾了對蝦對氨基酸的吸收，蛋白代謝以利于病毒復制。本研究結果有助于深入了解病毒致病機制。
　　Part4：為比較凡納濱對蝦與氧化反應和信號轉導相關基因在

8、WSSV感染中的變化情況，本部分實驗采用實時熒光定量 PCR的技術分析白斑綜合征病毒（WSSV）感染凡納濱對蝦6、12、24、48、72五個時間段后鰓和類淋巴組織中硫氧還原蛋白（TRx）、p38信號通路（LvP38）、過氧化氫酶（CAT）以及過氧化物酶（POD）四種基因在mRNA轉錄水平的變化。結果表明，感染組對蝦的類淋巴組織中 TRx、LvP38、CAT、POD這四種基因在72 h時表達量最高，與對照組形成顯著性差異(P<0.05)；