柿單寧基于AMPK和miRNA調(diào)節(jié)非酒精性脂肪肝和前脂肪細胞分化的分子機制.pdf

1、本文旨在研究柿單寧對非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和前脂肪細胞分化的影響，確認柿單寧是否是柿及其提取物降脂的主體成分，并探討柿單寧調(diào)控脂質(zhì)代謝的機制。本文以高膽固醇飼料誘導(dǎo)大鼠肝臟脂肪積累，并結(jié)合體外實驗，初步研究了柿單寧降脂及對肝臟脂肪聚集的影響，隨后以高脂飼料（豬油+膽固醇）構(gòu)建大鼠NAFLD模型，證實柿單寧是柿果改善NAFLD的主要功效成分，并采用動物模型及細胞體系（人正常肝細胞L02細胞及前脂肪細胞3T3-L1細胞），結(jié)合re

2、altimeRT-PCR和westernblot等分析技術(shù)對柿單寧調(diào)節(jié)NAFLD脂質(zhì)代謝的信號通路進行了研究，比較了柿單寧及其結(jié)構(gòu)特征單元對肝脂肪變性的影響及機制，探討柿單寧的構(gòu)效關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　1.柿單寧體內(nèi)外降脂的作用
　　為了研究柿單寧的降脂作用，我們采用高膽固醇飼料誘導(dǎo)大鼠高血脂及脂肪肝，研究柿單寧對血脂、肝脂的影響，并結(jié)合體外實驗，研究了柿單寧對胰脂酶和膽固醇酯酶活性的影響以及柿單寧與膽固醇膠束化、膽

3、汁酸的結(jié)合能力。結(jié)果表明，柿單寧能顯著降低大鼠血清和肝臟中甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量;肝組織形態(tài)學(xué)顯示柿單寧能降低肝臟脂肪的聚集，此外柿單寧還能增加血清中卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的活性，促進糞便中膽酸的排泄。同時，我們也檢測了抗氧化能力的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果表明柿單寧能減輕高膽固醇飼料誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，增強血清中抗氧化酶的活力。體外實驗研究表明，

4、柿單寧能抑制胰脂酶（IC50為0.445mg/mL）和膽固醇酯酶（IC50為0.442mg/mL）的活性，柿單寧對胰脂酶的抑制類型為非競爭性抑制;柿單寧可降低膽固醇膠束化的溶解性，且與膽酸和脫氧膽酸具有較強的結(jié)合能力，能降低腸道對脂質(zhì)和膽汁酸的吸收。這些結(jié)果表明柿單寧可能是柿及其提取物降脂的主體成分。
　　2.柿單寧是柿果基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途徑改善NAFLD的主體成分
　　采用高脂(HF，38％的能量來自脂肪

5、)飼料誘導(dǎo)大鼠NAFLD的形成，同時給予或不給予0.5％的柿單寧，4.2％的柿果凍干粉（含有相同量的柿單寧），研究柿單寧和柿果對NAFLD的影響及機理。實驗9周后，我們發(fā)現(xiàn)，柿單寧和柿果均能顯著降低(P＜0.05)大鼠血清TG和游離脂肪酸含量，升高HDL-C水平;增加糞便中TG、TC和膽汁酸的排泄，改善肝脂肪變性和炎性細胞浸潤。RealtimeRT-PCR結(jié)果表明，柿單寧和柿果還能顯著(P＜0.05)下調(diào)脂肪生成相關(guān)基因的表達，如固醇調(diào)

6、節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)和硬脂酰輔酶A脫氫酶1(SCD1);上調(diào)脂肪氧化相關(guān)基因的表達，如肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)。Westernblot結(jié)果顯示，在柿單寧和柿果的作用下，肝臟中AMPK被顯著(P＜0.05)激活。此外，柿單寧和柿果還能顯著降低(P＜0.05)肝臟中炎癥因子的含量和核因子κB(NFκB)的蛋白表達。提示柿單寧是柿果改善高脂誘導(dǎo)的肝脂肪變性和慢性炎癥反應(yīng)的主體成分，其作用機理

7、與激活A(yù)MPK信號通路有關(guān)。
　　3.柿單寧基于miR-122和miR-33b調(diào)節(jié)人正常肝細胞L02單純性脂肪積累
　　我們以0.4mmol/L的油酸誘導(dǎo)人正常肝細胞L02單純性脂肪變性模型，研究柿單寧及其主要特征單元對脂質(zhì)代謝的機制，結(jié)果表明，柿單寧及其主要特征單元能降低細胞內(nèi)TG的積累，其中A型連接ECG二聚體、A型連接EGCG二聚體作用最強，與柿單寧作用相當(dāng)，而A型連接EC二聚體和B型連接二聚體作用較弱。柿單寧及其主要

8、特征單元降低L02細胞脂肪合成相關(guān)基因SREBP1C和脂肪酸合成酶(FAS)的表達，但并不增加脂肪酸氧化基因CPT1的表達和AMPK的磷酸化，提示其抑制L02細胞脂肪的積累不是通過AMPK信號通路實現(xiàn)的。并且柿單寧及其主要特征單元可抑制人肝細胞L02中miR-122和miR-33b以及下游脂肪合成相關(guān)基因SREBP1C和FAS的表達。柿單寧對以上基因表達的抑制從3h開始，而二聚體在0.5h時即可表現(xiàn)出很強的抑制作用。柿單寧通過miR-1

9、22和miR-33b抑制油酸誘導(dǎo)的L02肝細胞脂肪變性，這種作用主要歸功于結(jié)構(gòu)中ECG和EGCG單元以及黃烷醇的A型連接方式。
　　4.柿單寧基于miR-27a/b抑制前脂肪細胞3T3-L1的分化
　　柿單寧濃度為60μg/mL時對前脂肪細胞3T3-L1成脂分化的抑制率達到了68.6％，這種作用主要發(fā)生在細胞分化早期階段，阻礙細胞的克隆擴增。柿單寧可降低前脂肪細胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶增值激活受體γ（PPARγ）、CC

10、AAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)和SREBP1C的表達，降低其下游基因FAS、ACC1等的表達，且呈劑量依賴關(guān)系。柿單寧可上調(diào)前脂肪細胞3T3-L1中miR-27a和miR-27b的表達，其靶基因PPARγ的蛋白表達也受到抑制?？傊羻螌幙赏ㄟ^調(diào)控miR-27a/b-PPARγ信號通路抑制前脂肪細胞的分化，減少細胞內(nèi)脂肪的積累。
　　5.柿單寧主要特征單元基于miR-27a/b抑制前脂肪細胞3T3-L1的分化
　　柿

11、單寧中含量最為豐富的兩種特征單元（A型連接ECG二聚體和EGCG二聚體）具有很好的抑制前脂肪細胞3T3-L1成脂分化的效果，這種抑制作用主要發(fā)生在細胞分化早期階段，阻礙有絲分裂克隆擴增(MCE)進程。A型連接EC二聚體也能在一定程度上抑制前脂肪細胞的成脂分化，但效果不如前兩種，B型連接EC二聚體無此作用。A型連接ECG二聚體和EGCG二聚體可通過上調(diào)前脂肪細胞3T3-L1中miR-27a和miR-27b的表達，進而抑制其靶基因PPARγ