偽狂犬病毒gB基因在畢赤酵母中的表達(dá)及初步應(yīng)用.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)又稱(chēng)Aujeszky's病，其病原偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是皰疹病毒科(Herpes viridae)，α-皰疹病毒亞科(Alpha herpes viridae)的成員，基因組大小約150Kb，G+C含量高達(dá)73％，是一種線(xiàn)狀雙鏈DNA病毒。偽狂犬病可引起牛、羊及野生動(dòng)物的發(fā)熱、奇癢(除豬外)、腦脊髓炎等癥狀，豬是偽狂犬病毒(PRV)的天然宿主和主要感染源。偽

2、狂犬病是世界性的重要傳染病之一，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其危害僅次于豬瘟和口蹄疫。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，囊膜糖蛋白gB是偽狂犬病毒(PRV)的一個(gè)重要免疫原，能介導(dǎo)病毒與細(xì)胞間的相互作用，屬于必需糖蛋白，也是皰疹病毒中最為保守的基因。gB糖蛋白作為動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的主要靶抗原，在偽狂犬病診斷和根除計(jì)劃中發(fā)揮著重要的作用。
　　 本研究選擇偽狂犬病毒gB糖蛋白作為研究對(duì)象，利用DNAMAN和Oligo6.3軟件對(duì)Geneban

3、k中登錄的各偽狂犬病毒(PRV)gB基因序列進(jìn)行分析，分別設(shè)計(jì)合成了3對(duì)特異性引物：一對(duì)不含酶切位點(diǎn)引物、一對(duì)熒光特異性引物和TaqMan探針、一對(duì)含有EcoRI和XbaI酶切位點(diǎn)引物。
　　 1、通過(guò)DNA/RNA提取試劑盒對(duì)PRV病毒進(jìn)行DNA的提取，利用普通PCR技術(shù)獲得了全長(zhǎng)約2.8Kb的PRV-gB基因，并克隆至pMD20-T載體，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD20-gB。通過(guò)基因測(cè)序和Genebank分析其生物學(xué)特性，最終

4、鑒定本實(shí)驗(yàn)室所分離PRV毒株為南陽(yáng)株(Namyangju)。
　　 2、將重組質(zhì)粒pMD20-gB作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，利用熒光特異性引物和TaqMan探針建立了一種快速檢測(cè)偽狂犬病毒的熒光定量PCR方法。該檢測(cè)技術(shù)具有較高的靈敏性、特異性和可靠性。對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果表明，所建立的偽狂犬病毒(PRV)TaqMan熒光定量PCR最低檢測(cè)極限可達(dá)1.50×102拷貝/反應(yīng)，相比于普通PCR方法其靈敏度高1000倍以上，并且重復(fù)性好。同

5、時(shí)對(duì)60份臨床樣品的檢測(cè)，熒光定量PCR不僅檢出了普通PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，且檢出了2份普通PCR未檢出的樣品，進(jìn)一步證實(shí)了該方法快速、靈敏性好，可用于PRV感染的早期快速定量檢測(cè)和肉類(lèi)食品進(jìn)出口檢疫。
　　 3、為獲得大量的、成本較低的gB診斷抗原，本研究中用含有EcoRI和XbaI酶切位點(diǎn)的特異性引物，利用普通PCR技術(shù)以重組質(zhì)粒pMD20-gB為模板，重新擴(kuò)增gB基因全序列，成功構(gòu)建了含gB主要杭原表位基因的Pichia

6、酵母分泌表達(dá)載體pPICZαA-gB，并通過(guò)測(cè)序和DNAMAN軟件分析表明該基因無(wú)突變，蛋白編碼正確無(wú)誤，可繼續(xù)試驗(yàn)。選擇Pichia酵母X-33株感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化克隆重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-gB，30℃溫箱培養(yǎng)一周左右，取單菌落液體培養(yǎng)，提取酵母基因組進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明本研究成功獲得了可分泌表達(dá)PRV-gB主要杭原表位基因的重組菌。經(jīng)1％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白大小約為103KD。同時(shí)研究了目的蛋白表

7、達(dá)量與各個(gè)培養(yǎng)條件的關(guān)系，優(yōu)化后的最佳表達(dá)條件為：誘導(dǎo)初期的培養(yǎng)液所含菌體濃度OD600值為1.2，28.8℃搖床劇烈震蕩，每24h補(bǔ)加甲醇終濃度為1％，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為72h，蛋白表達(dá)量達(dá)最大值。在最佳表達(dá)條件下所誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白經(jīng)純化后含量達(dá)8.715mg/mL。
　　 4、將以上濃縮純化后的重組蛋白gB作為抗原進(jìn)行包被，制備ELISA抗體檢測(cè)板，對(duì)PRV-gB陽(yáng)性/陰性血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，此目的蛋白具有很

8、好的反應(yīng)原性，可作為檢測(cè)用抗原。利用已建立的gB-ELISA方法對(duì)豬瘟、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征的陽(yáng)性血清進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明gB蛋白與其他病毒陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，有較好的特異性，可以用于PRV-gB蛋白抗體的檢測(cè)。將gB抗原免疫新西蘭大白兔，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和中和試驗(yàn)測(cè)得血清抗體效價(jià)平均達(dá)到1:8，說(shuō)明了gB蛋白具有很好的免疫原性。對(duì)已達(dá)到一定抗體水平的兔子采血，收集血清制備gB抗血清，為規(guī)范診斷檢測(cè)試劑和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供一定的