波形蛋白啟動(dòng)子去甲基化在TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用研究.pdf

1、 目的：作為慢性腎臟疾病(chronic kidney diseases, CKD)發(fā)展到終末期,甚至完全失去腎臟功能的共同途徑,腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)被認(rèn)為是這一疾病發(fā)展過(guò)程的主要環(huán)節(jié),而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenehymal transition,EMT)又是RIF發(fā)展過(guò)程中的重要組成部分,主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)成分的逐漸增多,如波形蛋白(vimentin

2、)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、膠原蛋白等,同時(shí)伴隨有上皮成分的減少。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是目前公認(rèn)的最主要的腎臟促纖維化細(xì)胞因子,在一定條件和TGF-β1誘導(dǎo)下,腎小管上皮細(xì)胞在體外可以發(fā)生EMT過(guò)程。再有,DNA甲基化修飾是表觀遺傳修飾的重要方式,可以通過(guò)調(diào)控某些基因位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)而改變基因表達(dá)情況,從而引起相應(yīng)的細(xì)胞表型,甚至功能的變化；甲基化轉(zhuǎn)移酶1(methyltransferase 1,DNMT1)作為調(diào)控基因甲

3、基化狀態(tài)的一種重要酶類(lèi),可能參與了某些基因的甲基化修飾過(guò)程。因此,我們旨在通過(guò)觀察體外 TGF-β1 誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells, NRK)轉(zhuǎn)分化(trans-differentiation)過(guò)程中,細(xì)胞形態(tài)的改變,以及上皮細(xì)胞源性蛋白(AE1/AE3)和間質(zhì)細(xì)胞源性蛋白(vimentin)表達(dá)的變化情況,同時(shí)檢測(cè) DNMT1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平及波形蛋白(vimenti

4、n)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的變化,從而探討體外誘導(dǎo)的 EMT 過(guò)程中可能的發(fā)生機(jī)制,為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。方法：首先,體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK),將 NRK 細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(TGF-β1誘導(dǎo)組),經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞誘導(dǎo)后,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化情況,并 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色(ICC)的方法觀察兩組細(xì)胞廣譜細(xì)胞角蛋白(AE1/AE3)及vimentin表達(dá)的情況；然后,應(yīng)用重亞硫酸鹽PCR直接測(cè)序(Bisulfite

5、Genomic Sequence, BSP)的方法檢測(cè)誘導(dǎo)前、后vimentin啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)變化；最后,采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法分別檢測(cè)誘導(dǎo)前、后DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果：體外 TGF-β1誘導(dǎo)前、后,NRK 細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了不同程度的改變,并趨于間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；經(jīng)灰度值測(cè)定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,體外TGF-β1誘導(dǎo)的NRK細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型

6、中,NRK細(xì)胞DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí),誘導(dǎo)前、后vimentin啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)發(fā)生改變,誘導(dǎo)后vimentin啟動(dòng)子呈去甲基化狀態(tài),且vimentin蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：在體外TGF-β1誘導(dǎo)后,NRK細(xì)胞發(fā)生了上皮細(xì)胞到間質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化,主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)趨于間質(zhì)細(xì)胞,且出現(xiàn)上皮源性抗原標(biāo)志(AE1/AE3)表達(dá)的降低和

7、間葉源性抗原標(biāo)志(vimentin)表達(dá)的升高；誘導(dǎo)前、后 NRK細(xì)胞 vimentin 表達(dá)量的明顯升高可能與其啟動(dòng)子區(qū),即包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近靠近第一個(gè)外顯子的 200-300bp 序列在內(nèi)的某些基因位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的變化有關(guān)；DNMT1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)在誘導(dǎo)前、后的改變提示,其可能在vimentin甲基化狀態(tài)的改變過(guò)程中起調(diào)控作用,并可能間接影響vimentin蛋白的表達(dá),因此vimentin啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和DNMT1表達(dá)