隱孢子蟲CaNBD基因的克隆與真核表達(dá).pdf

1、隱孢子蟲病是由隱孢子蟲感染引起的一種呈世界性分布的人畜共患寄生蟲病。近年來(lái)，隱孢子蟲因在嬰幼兒、幼畜、免疫缺陷者，尤其是艾滋病(AIDS)患者中感染率高且危害嚴(yán)重而倍受重視。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)隱孢子蟲病已進(jìn)行了廣泛而深入的研究，但迄今仍未發(fā)現(xiàn)公認(rèn)有效的治療隱孢子蟲病的藥物。由于隱孢子蟲有新的簡(jiǎn)化代謝途徑，能依靠膜上ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CpABC)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)作用，并且具有逃避免疫和多向抗藥性的特性，致使許多疫苗和藥物均難以成

2、功防治隱孢子蟲病。因此，深入進(jìn)行隱孢子蟲CpABC蛋白研究，對(duì)揭示隱孢子蟲致病機(jī)理，篩選出治療隱孢子蟲病的特效藥物具有重要意義。
　　 本課題先用PCR方法擴(kuò)增奶牛源安氏隱孢子蟲ABC蛋白基因的核苷酸結(jié)合區(qū)-CaNBD，克隆、測(cè)序，獲得安氏隱孢子蟲CaNBD基因；接著采用4種方法分離并培養(yǎng)小鼠腸上皮細(xì)胞(IEC)，建立小鼠IEC細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，并獲得隱孢子蟲所寄生的腸上皮細(xì)胞體外模型；然后將目的基因片段CaNBD與真核表達(dá)載

3、體pEGFP-C1連接，構(gòu)建CaNBD真核表達(dá)載體，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組真核質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠IEC細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，觀察蛋白表達(dá)情況；最后檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)外液體中4種離子的濃度，用SPSS16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，明確CaNBD蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
　　 首先，用糞便DNA提取試劑盒抽提安氏隱孢子蟲基因組DNA作為模板，合成瘧原蟲ABC蛋白基因序列的簡(jiǎn)并引物(加酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BglⅡ、起始子ATG和終止子TAA)，進(jìn)行安氏隱

4、孢子蟲ABC蛋白核苷酸結(jié)合區(qū)基因(CaNBD)的擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，得到大小為411bp的目的基因片段，翻譯為氨基酸序列，大小為137aa，經(jīng)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所獲安氏隱孢子蟲CaNBD氨基酸序列存在ABC蛋白家族的特征序列“LSGGQ”和隱孢子蟲ABC蛋白模體WalkerA-“GETGSGKST”、WalkerB-“DEATSSLD”，因此，初步確定本次PCR所擴(kuò)增出的411bp的核苷酸產(chǎn)物是安氏隱孢子蟲ABC蛋白的一段ATP結(jié)合區(qū)基

5、因序列，命名為CaNBD。將CaNBD基因的克隆重組質(zhì)粒與真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1均用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglⅡ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-CaNBD，通過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了pEGFP-C1-CaNBD。
　　 其次，采用組織塊培養(yǎng)法、嗜熱菌蛋白酶消化法、膠原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ聯(lián)合消化法以及膠原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ聯(lián)合消化法4種方法分離到小鼠原代腸上皮

6、細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞免疫組織化學(xué)法和細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞特異性鑒定，結(jié)果4種分離方法均能得到小鼠腸上皮細(xì)胞，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)組織塊培養(yǎng)法所獲IEC細(xì)胞中成纖維細(xì)胞污染較嚴(yán)重；膠原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分離法獲得的IEC細(xì)胞成活率不高；嗜熱菌蛋白酶消化法及膠原酶Ⅺ與中性蛋白酶Ⅰ聯(lián)合消化法2種方法所獲得小鼠IEC細(xì)胞成活率高、純度較好，適合用于真核載體的轉(zhuǎn)染。
　　 最后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-CaNBD

7、導(dǎo)入小鼠IEC原代細(xì)胞內(nèi)，分別用空質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染小鼠IEC細(xì)胞和未經(jīng)任何處理的IEC細(xì)胞做對(duì)照組和空白組，結(jié)果在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組有熒光出現(xiàn)，空白組未見(jiàn)熒光，表明目的基因CaNBD在IEC細(xì)胞中成功表達(dá)。收集細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎儀破碎制為懸液作為細(xì)胞內(nèi)液，收集細(xì)胞培養(yǎng)液作為細(xì)胞外液，用溶液離子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液中4種離子的濃度，用SPSS16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明在CaNBD蛋白的作用下，

8、這4種離子從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。因此，確定此次獲得的CaNBD是安氏隱孢子蟲ABC蛋白的核苷酸結(jié)合區(qū)基因，且CaNBD蛋白有轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用。
　　 綜上所述，本課題在國(guó)內(nèi)外首次克隆安氏隱孢子蟲ABC蛋白的核苷酸結(jié)合區(qū)基因-CaNBD，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-CaNBD，通過(guò)建立原代小鼠IEC培養(yǎng)方法，獲得原代小鼠IEC，將CaNBD基因?qū)胄∈驣EC中成功表達(dá)，并通過(guò)檢測(cè)4種離子濃度，發(fā)現(xiàn)CaNBD蛋白有轉(zhuǎn)運(yùn)這4種