新孢子蟲(chóng)SRS2基因的克隆、表達(dá)及ELISA方法的建立.pdf

1、新孢子蟲(chóng)（Neospora caninum）是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲(chóng)，主要引起牛、狗等動(dòng)物的神經(jīng)肌肉性疾病和流產(chǎn)，尤其是奶牛的流產(chǎn)，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展。新孢子蟲(chóng)病的早期診斷是有效控制該病發(fā)生和蔓延的重要手段。研究表明，新孢子蟲(chóng)表面蛋白NcSRS2具有較好的免疫原性，是新孢子蟲(chóng)病診斷和疫苗研究的重要候選抗原。本試驗(yàn)擬采用新孢子蟲(chóng)表面蛋白NcSRS2建立間接ELISA診斷方法，用于牛新孢子蟲(chóng)病診斷。 參考GenBank登錄的新孢

2、子蟲(chóng)NcSRS2全基因序列，在163～1141處設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出NcSRS2的相應(yīng)片段，構(gòu)建T-A克隆，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序分析后，再亞克隆到表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-32a-NcSRS2t，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定后，保存重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pET-32a-SRS2t轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白NcSRS2t。Western blotting檢測(cè)，表達(dá)

3、的融合蛋白NcSRS2t能夠被新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性血清所識(shí)別。 將表達(dá)的融合蛋白NcSRS2t收集、純化后作為抗原，包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，初步建立檢測(cè)牛新孢子蟲(chóng)抗體的間接ELISA。試驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白的最佳包被濃度為5μg/ml，最佳封閉時(shí)間為2h，檢測(cè)血清稀釋度為1：200，抗原和抗體作用時(shí)間為1h，HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG的工作濃度為1：5000，最佳顯色時(shí)間為10min，用21mol/LH2SO4為終止液，確定陰陽(yáng)性的臨界O