大豆凝集素基因lec-s的克隆及轉化煙草的研究.pdf

1、凝集素是具有一個或多個非催化性的結構域，可與單糖或多糖可逆結合的一類蛋白質或糖蛋白。目前為止，人們已經(jīng)從多種植物、動物、細菌、病毒和真菌中分離出凝集素。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的許多凝集素中，植物凝集素是最大的一個家族，尤以豆科植物的種子中凝集素含量最為豐富。以往的報道表明，植物凝集素在植物中具有防御功能。在正常情況下，植物凝集素僅作為儲存蛋白而不表現(xiàn)任何特異活性;一旦植物受到微生物、昆蟲等動物的危害，植物凝集素就會從植物的受害細胞釋放出來，與病

2、原物或昆蟲消化道特定的糖蛋白結合，擾亂其正常的生理生化功能，最終表現(xiàn)為對病蟲害的抗性。目前為止，已經(jīng)有雪花蓮凝集素基因、豌豆外源凝集素基因、菜豆凝集素基因、莧科凝集素基因以及Ⅱ型核糖體失活蛋白基因等許多植物凝集素基因成功地用于植物抗病蟲害基因工程。
　　 在本實驗室的前期工作中，我們利用RACE和反向PCR技術從大豆品種合豐29號中分離得到一個新的大豆凝集素基因，命名為lec-s(DQ235094)。本研究旨在將編碼大豆凝集素的

3、基因lec-s轉化煙草，以期提高煙草的抗病性和抗蟲性，為將來該基因應用于植物病害的防治提供依據(jù)。
　　 通過RT-PCR方法，我們從大豆抗病品種合豐29號中克隆lec-s基因，將其插入入植物表達載體pBI121，構建植物表達載體pBI121::lec-s。將重組載體轉化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)酶切、測序驗證后，通過凍融法轉化根癌農(nóng)桿菌EHA105。菌落PCR和酶切檢測后，挑選陽性克隆供轉化煙草使用。
　　 采用根癌農(nóng)桿菌

4、EHA105介導的葉盤法，將重組表達質粒pBI121:: lec-s轉化煙草，獲得了抗卡那霉素的轉基因煙草植株。經(jīng)PCR、Southern雜交和RT-PCR檢測證明lec-s基因已整合到煙草基因組中，并且能在轉錄水平正常表達。
　　 抗TMV鑒定結果表明，轉基因煙草葉片上的病斑數(shù)顯著減少，與對照相比病斑減少了41.72％～43.79％，說明轉基因煙草表現(xiàn)出對TMV的良好抗性。抗煙草疫霉（Phytophthora nicotian

5、ae）的測定發(fā)現(xiàn)，轉基因煙草強于未轉化煙草和轉空載體煙草。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，接種TMV后，抗病防衛(wèi)基因（PR-1a、GST1、Pa1和hsr515）在轉基因煙草葉片中顯著上調表達。這些結果表明，大豆凝集素基因lec-s轉化煙草可對TMV產(chǎn)生抗性，其作用機制可能在于lec-s基因誘導抗病防衛(wèi)基因在植株體內的表達，增強了植株的系統(tǒng)抗性。此外轉基因煙草對甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的抗蟲實驗表明，大豆凝集素轉基因煙草也