豌豆早期結(jié)瘤素基因克隆與凝集素基因psl轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、結(jié)瘤固氮是豆科植物與根瘤菌專一性作用的結(jié)果。在根瘤菌的第一步入侵至根瘤形成的每一個過程中，都伴隨著宿主植物及根瘤菌特異性基因的表達(dá)。前人的研究已經(jīng)證明，植物凝集素在豆科植物識別根瘤菌的過程中起著不可缺少的重要作用，通過豆科植物間凝集素基因的轉(zhuǎn)化，可使一些豆科植物識別原本不能識別的根瘤菌。但是，人們在利用人上啟動子將豆科植物凝集素基因轉(zhuǎn)化到非豆科植物時，并未能使非豆科轉(zhuǎn)基因植株識別相應(yīng)的根瘤菌。鑒于此，有必要在非豆科植物上模擬豆科植物凝集

2、素的原始表達(dá)機(jī)制，研究非豆科植物與根瘤菌的相互作用。 結(jié)瘤素基因(Nodulin Gene)是指特異地存在于根瘤菌感染產(chǎn)生的根瘤細(xì)胞中并參與共生固氮作用的植物基因，它們對于根瘤結(jié)構(gòu)的形成及維持、固氮活性的保護(hù)以及固氮產(chǎn)物的代謝等都有重要作用。根據(jù)表達(dá)時間的先后，它可分為早期結(jié)瘤素基因和晚期結(jié)瘤素基因。早期結(jié)瘤素基因在根瘤發(fā)育早期表達(dá)，參與“根瘤菌——根毛”相互作用及根瘤形態(tài)發(fā)生過程，對植物與根瘤菌之間的信息傳遞、根瘤菌的侵染及根

3、瘤的形成有著重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個關(guān)鍵的早期結(jié)瘤素基因，并在一定程度上闡述了它們的功能，不過它們的工作機(jī)理仍有待進(jìn)一步闡明。這些關(guān)鍵早期結(jié)瘤素基因在轉(zhuǎn)化到非豆科植物中后，是否能發(fā)揮相應(yīng)的功能，也需要進(jìn)一步的探索。 本實(shí)驗(yàn)通過PCR技術(shù)從豌豆基因組DNA中克隆出豌豆凝集素基因(psl)及早期結(jié)瘤素基因PsENOD12A、PsSYM10、PsENOD40，構(gòu)建了psl基因的植物表達(dá)載體pVCT-PsL，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ps

4、l基因?qū)霟煵荨Ｖ饕獙?shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.psl基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草 以豌豆(Pisum sativum L.)基因組DNA為模板，通過設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得psl基因。序列分析表明，該基因全長1948 bp，包括編碼275個氨基酸的828 bp的開放閱讀框、854bp的5’端控制區(qū)和266bp的3’端非翻譯區(qū)。與已報(bào)道的序列(GenBank登錄號X66368)相比較，核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序

5、列同源性分別為99.4％和100％。將psl基因插入到pVCT2020，構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體pVCT-PsL。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將psl基因?qū)霟煵?Nicotiana tobacum L.cv．Wisconsin38)中，共獲得10個獨(dú)立的卡那霉素抗性煙草株系，移栽后全部成活并開花結(jié)果。PCR檢測初步確定psl基因已轉(zhuǎn)入煙草基因組中。 2.豌豆PsENOD12A基因的克隆 以豌豆基因組DNA為模板，通過設(shè)計(jì)一對特異

6、引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得PsENOD12.4基因。序列分析表明，該基因全長1282 bp，含有編碼110個氨基酸的333 bp的開放閱讀框和936 bp的5’端控制區(qū)。與GenBank公布的已知序列(X81366)相比，其核苷酸序列及推測的氨基酸序列的同源率分別為99.9％(僅有1個堿基不同)和100％。 3.豌豆PsSYM10基因的克隆 以豌豆基因組DNA為模板，通過設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得PsSYM1

7、0基因。序列分析表明，該基岡全長3310 bp，包括編碼594個氨基酸的1785 bp的開放閱讀框、1000 bp的5’端控制區(qū)和525 bp的3’端非翻譯區(qū)。與GenBank公布的已知序列(AJ575250)相比，其核營酸序列及推測的氨基酸序列的同源率分別為98.8％和100％。 4.豌豆PsENOD40基因的克隆 以豌豆基因組DNA為模板，通過設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得PsENOD40基因。序列分析表明，該