表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒多表位肽重組豬痘病毒的構(gòu)建.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)能引起母豬生殖障礙和豬嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為影響?zhàn)B豬業(yè)的主要疾病之一。目前已經(jīng)有商業(yè)化的PRRSV弱毒苗和滅活苗，但現(xiàn)有疫苗保護(hù)力不足并存在若干缺點(diǎn)，因此迫切需要新的有效的PRRSV疫苗。表位疫苗和活病毒載體疫苗是在現(xiàn)代疫苗發(fā)展中出現(xiàn)的兩種新型疫苗設(shè)計(jì)策略，本研究試圖利用這

2、兩種方式研制新型PRRSV疫苗。
　　 為確定PRRSV中和抗體識別的抗原表位，本研究以3株具有高中和效價(jià)的PRRSV單克隆抗體A1、A2和A7為靶標(biāo)，利用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫從中篩選高親和力的噬菌體變異體。經(jīng)三輪親和選擇和ELISA檢測，每株單抗均篩選到12個(gè)陽性克隆。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A1識別的12個(gè)陽性克隆中有7個(gè)序列為YSTNWKNLSSLS，所有陽性克隆中都包含NWKN基序;A2和A7識別的12個(gè)陽性克隆中分別有6個(gè)和5

3、個(gè)都包含SRHDHIH基序。同源性分析表明，A1識別的NWKN基序與PRRSV的任何結(jié)構(gòu)蛋白無同源性;A2和A7識別的SRHDHIH基序與PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白GP3的囊膜外結(jié)構(gòu)域存在高度同源性。表位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GP3中156到161位的PRHDNI免疫原性和親水性高，很可能是一個(gè)線性中和表位。
　　 為利用基于表位的疫苗設(shè)計(jì)策略研制新型PRRSV疫苗，人工設(shè)計(jì)了一段長為321bp的多表位肽(HP)基因。將其克隆到表達(dá)載體pET-3

4、2a(+)中，通過PCR和雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pET-32a-HP，然后將重組質(zhì)粒pET-32a-HP轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliBL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)PCR陽性克隆菌。SDS-PAGE顯示，經(jīng)鎳柱親和層析純化后的重組蛋白HP大小約30kD。免疫印跡顯示，重組蛋白HP能被PRRSV單克隆抗體A2、A7識別。
　　 為研制安全有效的新型PRRSV疫苗，本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的帶有eGFP標(biāo)記的用于高效表達(dá)外源基因的重組豬痘病毒載體系統(tǒng)，通

5、過與野生豬痘基因組發(fā)生同源重組，獲得了一個(gè)表達(dá)多表位肽HP基因片段的重組豬痘病毒rSPV-HP。利用PCR、免疫印跡和間接免疫熒光對純化10代的重組豬痘病毒rSPV-HP進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明感染rSPV-HP的PK15細(xì)胞中表達(dá)大小為10KD的多表位肽HP。在免疫rSPV-HPICR小鼠內(nèi)檢測到高水平抗HP特異性抗體，抗PRRSV中和抗體效價(jià)為1∶60。希望該重組豬痘病毒rSPV-HP能成為新型PRRSV疫苗候選者用于預(yù)防豬感染PRRS