表達豬繁殖與呼吸綜合癥病毒多表位肽重組豬痘病毒的構建.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)能引起母豬生殖障礙和豬嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失，已經成為影響?zhàn)B豬業(yè)的主要疾病之一。目前已經有商業(yè)化的PRRSV弱毒苗和滅活苗，但現(xiàn)有疫苗保護力不足并存在若干缺點，因此迫切需要新的有效的PRRSV疫苗。表位疫苗和活病毒載體疫苗是在現(xiàn)代疫苗發(fā)展中出現(xiàn)的兩種新型疫苗設計策略，本研究試圖利用這

2、兩種方式研制新型PRRSV疫苗。
　　 為確定PRRSV中和抗體識別的抗原表位，本研究以3株具有高中和效價的PRRSV單克隆抗體A1、A2和A7為靶標，利用噬菌體展示隨機12肽庫從中篩選高親和力的噬菌體變異體。經三輪親和選擇和ELISA檢測，每株單抗均篩選到12個陽性克隆。測序結果發(fā)現(xiàn)，A1識別的12個陽性克隆中有7個序列為YSTNWKNLSSLS，所有陽性克隆中都包含NWKN基序;A2和A7識別的12個陽性克隆中分別有6個和5

3、個都包含SRHDHIH基序。同源性分析表明，A1識別的NWKN基序與PRRSV的任何結構蛋白無同源性;A2和A7識別的SRHDHIH基序與PRRSV的結構蛋白GP3的囊膜外結構域存在高度同源性。表位預測發(fā)現(xiàn)，GP3中156到161位的PRHDNI免疫原性和親水性高，很可能是一個線性中和表位。
　　 為利用基于表位的疫苗設計策略研制新型PRRSV疫苗，人工設計了一段長為321bp的多表位肽(HP)基因。將其克隆到表達載體pET-3

4、2a(+)中，通過PCR和雙酶切鑒定重組質粒pET-32a-HP，然后將重組質粒pET-32a-HP轉化進E.coliBL21，IPTG誘導表達PCR陽性克隆菌。SDS-PAGE顯示，經鎳柱親和層析純化后的重組蛋白HP大小約30kD。免疫印跡顯示，重組蛋白HP能被PRRSV單克隆抗體A2、A7識別。
　　 為研制安全有效的新型PRRSV疫苗，本研究利用本實驗室構建的帶有eGFP標記的用于高效表達外源基因的重組豬痘病毒載體系統(tǒng)，通

5、過與野生豬痘基因組發(fā)生同源重組，獲得了一個表達多表位肽HP基因片段的重組豬痘病毒rSPV-HP。利用PCR、免疫印跡和間接免疫熒光對純化10代的重組豬痘病毒rSPV-HP進行了鑒定，結果表明感染rSPV-HP的PK15細胞中表達大小為10KD的多表位肽HP。在免疫rSPV-HPICR小鼠內檢測到高水平抗HP特異性抗體，抗PRRSV中和抗體效價為1∶60。希望該重組豬痘病毒rSPV-HP能成為新型PRRSV疫苗候選者用于預防豬感染PRRS